Modulatory CFTR zmieniają nie tylko czynność płuc. Efekty terapii widać w pojedynczych komórkach dróg oddechowych

Terapia elexakaftorem, tezakaftorem i iwakaftorem (ETI) u dzieci z mukowiscydozą nie tylko poprawia parametry kliniczne związane z funkcją CFTR. Analizy pojedynczych komórek pokazują, że już po trzech miesiącach leczenia dochodzi do zmian w nabłonku dróg oddechowych, częściowego przywrócenia zaburzonych mechanizmów odporności wrodzonej oraz zmniejszenia aktywności zapalnej komórek układu immunologicznego. Jednocześnie nie wszystkie nieprawidłowości molekularne ulegają pełnej normalizacji.

Co dzieje się w drogach oddechowych po rozpoczęciu terapii ETI?

Co dzieje się bezpośrednio w komórkach dróg oddechowych, gdy dziecko z mukowiscydozą rozpoczyna terapię modulatorami CFTR w postaci elexakaftoru, tezakaftoru i iwakaftoru (ETI, Kaftrio)? Dlaczego pacjenci z taką samą lub podobną mutacją genu CFTR nie zawsze odnoszą identyczne korzyści z leczenia?

Na te pytania próbowali odpowiedzieć badacze z zespołów kierowanych przez dr. med. Simona Gräbera z Charité – Universitätsmedizin Berlin oraz dr Saskię Trump z Berlin Institute of Health at Charité. Projekt był finansowany przez Mukoviszidose e.V., a jego wyniki opublikowano w „American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine”.

Analizy pokazały, że działanie ETI można obserwować nie tylko za pomocą klasycznych parametrów klinicznych, takich jak czynność płuc czy stężenie chlorków w pocie. Zmiany zachodzą również na poziomie poszczególnych komórek nabłonka i układu odpornościowego obecnych w błonie śluzowej dróg oddechowych.

Analiza pojedynczych komórek przed i po rozpoczęciu leczenia

W badaniu wykorzystano wymazy z nosa pobrane od 13 dzieci z mukowiscydozą w wieku od 6 do 11 lat. Próbki pobierano przed rozpoczęciem leczenia ETI oraz ponownie po około trzech miesiącach terapii. Wszystkie dzieci miały co najmniej jeden allel F508del.

Materiał porównano z próbkami pochodzącymi od 12 zdrowych dzieci w podobnym wieku. Do badania zastosowano sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek, czyli single-cell RNA sequencing (scRNA-seq).

Metoda ta umożliwia analizowanie aktywności genów osobno w różnych populacjach komórek. Zamiast otrzymywać jeden uśredniony obraz dla całej próbki błony śluzowej, badacze mogli sprawdzić, jak na terapię reagują konkretne rodzaje komórek nabłonkowych oraz komórek układu odpornościowego.

Więcej komórek CFTR-dodatnich po trzech miesiącach terapii

Jednym z istotnych wyników była obserwacja dotycząca komórek wykazujących ekspresję CFTR. Przed rozpoczęciem terapii u dzieci z mukowiscydozą odsetek komórek CFTR-dodatnich był obniżony w kilku populacjach nabłonka dróg oddechowych.

Po trzech miesiącach stosowania ETI udział takich komórek przesuwał się w kierunku wartości obserwowanych u zdrowych dzieci. Szczególnie istotne zmiany dotyczyły między innymi komórek Club oraz komórek kubkowych. Obie populacje występują stosunkowo licznie w nabłonku dróg oddechowych i mogą uczestniczyć w utrzymywaniu jego prawidłowych funkcji.

Wyniki sugerują więc, że działanie ETI może wykraczać poza poprawę funkcji już obecnego białka CFTR. Terapia wiąże się również ze zmianami w organizacji i funkcjonowaniu całego środowiska komórkowego błony śluzowej.

„Nasze wyniki wskazują, że ETI wpływa nie tylko na pojedyncze zmiany molekularne, lecz ogólnie przyczynia się do stabilizacji równowagi błony śluzowej. Podstawowe funkcje i współdziałanie różnych typów komórek w błonie śluzowej dróg oddechowych ponownie zbliżają się dzięki temu do stanu obserwowanego u osób zdrowych”.

dr Saskia Trump, Berlin Institute of Health at Charité

ETI wpływa także na mechanizmy odporności wrodzonej

Badacze znaleźli również dowody wskazujące, że terapia ETI częściowo przywraca zaburzone szlaki sygnałowe odporności wrodzonej. Szczególną uwagę zwrócono na szlaki związane z interferonami.

Interferony należą do kluczowych mediatorów odpowiedzi immunologicznej i odgrywają ważną rolę między innymi w obronie przeciwwirusowej. W komórkach nabłonkowych dzieci z mukowiscydozą obserwowano nieprawidłowości w aktywności tych mechanizmów, natomiast po rozpoczęciu ETI część zmian przesuwała się w kierunku obrazu charakterystycznego dla zdrowej błony śluzowej.

Zmiany obejmowały również geny związane z głównym układem zgodności tkankowej – MHC. Układ ten uczestniczy w prezentacji antygenów i umożliwia układowi immunologicznemu rozpoznawanie struktur własnych oraz obcych.

Istotne efekty stwierdzono także bezpośrednio w komórkach odpornościowych. Po rozpoczęciu leczenia ETI zmniejszały się wzorce aktywności związane z zapaleniem, szczególnie w makrofagach i neutrofilach. Są to populacje komórek odgrywające ważną rolę w przewlekłej, nadmiernej odpowiedzi zapalnej występującej w drogach oddechowych osób z mukowiscydozą.

Wyniki sugerują zatem, że ETI może nie tylko poprawiać funkcję CFTR, ale również stabilizować mechanizmy obronne błony śluzowej i ograniczać część procesów zapalnych w drogach oddechowych.

Nie wszystkie nieprawidłowości znikają podczas leczenia

Badanie nie wykazało jednak całkowitego „wyzerowania” zmian związanych z mukowiscydozą. Pomimo wyraźnego działania ETI część nieprawidłowości molekularnych pozostawała obecna również po rozpoczęciu terapii.

Ma to istotne znaczenie interpretacyjne. ETI należy do wysoce skutecznych terapii modulatorami CFTR, ale wyniki analiz pojedynczych komórek wskazują, że nie wszystkie procesy patologiczne w błonie śluzowej dróg oddechowych zostają całkowicie przywrócone do stanu obserwowanego u zdrowych dzieci.

Wyniki pozostawiają zatem przestrzeń dla dalszych badań nad terapiami uzupełniającymi, strategiami ograniczającymi przewlekły stan zapalny oraz metodami pozwalającymi jeszcze skuteczniej chronić nabłonek dróg oddechowych.

Czy jeszcze wcześniejsze rozpoczęcie ETI może chronić drogi oddechowe?

W analizowanym badaniu uczestniczyły dzieci w wieku od 6 do 11 lat. Autorzy projektu zwracają uwagę, że jednym z kolejnych pytań badawczych powinno być ustalenie, czy rozpoczęcie terapii w jeszcze młodszym wieku mogłoby ograniczyć powstawanie i utrwalanie się nieprawidłowości komórkowych oraz molekularnych w błonie śluzowej dróg oddechowych.

„W naszym badaniu uczestniczyły dzieci w wieku od sześciu do jedenastu lat. Jeszcze wcześniejsze rozpoczęcie leczenia mogłoby potencjalnie pomóc od początku silniej ograniczyć związane z chorobą zmiany molekularne i komórkowe w błonie śluzowej dróg oddechowych oraz utrzymać jej rozwój bliżej stanu zdrowego. Przyszłe badania muszą wyjaśnić, w jakim stopniu rozpoczęcie terapii już we wcześniejszym wieku może przeciwdziałać powstawaniu i utrwalaniu się takich zmian”.

dr med. Simon Gräber, Charité – Universitätsmedizin Berlin

Badanie wskazuje również na możliwe zastosowanie analiz pojedynczych komórek w medycynie bardziej spersonalizowanej. Skoro pacjenci z podobnym genotypem mogą w różnym stopniu odpowiadać na leczenie, charakterystyka komórek nabłonkowych i immunologicznych może w przyszłości pomóc w poszukiwaniu biomarkerów pozwalających przewidywać indywidualną odpowiedź na terapię.

Takie biomarkery mogłyby potencjalnie pomóc w identyfikowaniu pacjentów wymagających dodatkowych interwencji oraz w projektowaniu bardziej zindywidualizowanych strategii leczenia.

Projekt badawczy

• Projekt: wpływ terapii ETI na transkryptom pojedynczych natywnych komórek nabłonka dróg oddechowych i komórek odpornościowych u osób z mukowiscydozą.
• Kierownictwo projektu: dr med. Simon Gräber, Charité – Universitätsmedizin Berlin, oraz dr Saskia Trump, Berlin Institute of Health at Charité.
• Finansowanie: Mukoviszidose e.V.
• Wartość finansowania: 188 000 euro.
• Okres realizacji: od 1 października 2022 r. do 31 marca 2025 r.
• Metoda: sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek uzyskanych z wymazów z nosa.

W praktyce klinicznej

Badanie pomaga zrozumieć, dlaczego korzyści wynikające ze stosowania ETI nie powinny być oceniane wyłącznie na podstawie zmian spirometrycznych czy innych klasycznych parametrów klinicznych. Terapia oddziałuje na procesy zachodzące wewnątrz nabłonka dróg oddechowych oraz w obecnych tam komórkach odpornościowych.

Jednocześnie utrzymywanie się części nieprawidłowości molekularnych przypomina, że bardzo wysoka skuteczność modulatorów CFTR nie jest równoznaczna z całkowitym usunięciem wszystkich następstw mukowiscydozy w drogach oddechowych. Dalszych badań wymaga zarówno znaczenie bardzo wczesnego rozpoczynania leczenia, jak i możliwość identyfikowania pacjentów, u których odpowiedź biologiczna na terapię jest niepełna.