CXCL10 i mikrobiom płuc mogą wskazywać ryzyko CLAD po transplantacji

W opublikowanym online 14 sierpnia 2026 r. w American Journal of Transplantation prospektywnym badaniu kohortowym wykazano, że trzy cechy środowiska przeszczepionego płuca, oceniane w różnych momentach pierwszego roku po transplantacji, były związane z późniejszym rozwojem przewlekłej dysfunkcji przeszczepu płuca – chronic lung allograft dysfunction, CLAD. Były to: podwyższone stężenie IP10/CXCL10 w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego bezpośrednio po implantacji, niski stosunek względnej obfitości bakterii z rodzajów Streptococcus do Prevotella po 6 tygodniach oraz większe całkowite obciążenie bakteryjne po 6 miesiącach. W kohorcie 186 biorców przeszczepu płuca z chorobami innymi niż mukowiscydoza CLAD rozwinęło 70 osób, czyli 38%. Mediana obserwacji wyniosła 6,04 roku. Wyniki wskazują na możliwość wykorzystania w przyszłości czasowo zależnych biomarkerów do stratyfikacji ryzyka CLAD, jednak opracowany model wymaga walidacji w niezależnej kohorcie.

CLAD jako problem po transplantacji płuca

Przewlekła dysfunkcja przeszczepu płuca – chronic lung allograft dysfunction, CLAD – jest jednym z najważniejszych czynników ograniczających długoterminowe powodzenie transplantacji płuc. Z tego powodu trwają poszukiwania biologicznych cech obecnych jeszcze przed trwałym pogorszeniem czynności przeszczepionego narządu, które mogłyby wskazywać osoby szczególnie zagrożone rozwojem CLAD.

W analizowanym badaniu CLAD rozpoznawano zgodnie z kryteriami International Society for Heart and Lung Transplantation. Autorzy przyjęli wystąpienie dwóch pomiarów FEV1 wykazujących spadek o co najmniej 20% względem szczytowej wartości po transplantacji, przy braku alternatywnej przyczyny pogorszenia oraz bez późniejszego odzyskania czynności płuc.

Zespół skoncentrował się przede wszystkim na pierwszym roku po transplantacji. Badacze oceniali, czy skład mikrobiomu bakteryjnego, całkowite obciążenie bakteryjne oraz lokalne mediatory odpowiedzi immunologicznej są związane z późniejszym wystąpieniem CLAD.

Autorzy i ośrodki badawcze

Pierwszym autorem publikacji jest Carter Merenstein z Department of Microbiology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. Wśród współautorów znaleźli się m.in. John E. McGinniss, Robert Gallop, Samantha A. Whiteside, Krishna Pandya, Michelle Oyster, Jevon Graham-Wooten, Laurel Kalman, Emily Clausen, Edward Cantu, Joshua M. Diamond, Frederic D. Bushman, Jason D. Christie i Ronald G. Collman.

Autorzy reprezentowali przede wszystkim University of Pennsylvania Perelman School of Medicine w Filadelfii: Department of Microbiology, Pulmonary and Critical Care Division w Department of Medicine oraz Department of Surgery. Robert Gallop reprezentował Department of Mathematics, West Chester University. Ronald G. Collman, autor korespondencyjny, był afiliowany zarówno przy Department of Microbiology, jak i Pulmonary and Critical Care Division.

Pacjentów rekrutowano z Lung Transplant Outcomes Group w Penn Medicine. Praca została opublikowana jako artykuł typu Original Article w American Journal of Transplantation pod tytułem The Early Post-Transplantation Lung Microbiome and CXCL10 are Associated with Chronic Lung Allograft Dysfunction: A Prospective Study with 5-year Follow-Up.

Projekt badania i zastosowane metody

Badanie miało charakter prospektywny i podłużny. Do kohorty włączono 186 biorców przeszczepu płuca, rekrutowanych w Penn Medicine w latach 2013–2017. Obserwację prowadzono od transplantacji do rozwoju CLAD, zgonu niezwiązanego z CLAD albo zakończenia obserwacji w listopadzie 2022 r. Taki okres obserwacji miał umożliwić co najmniej pięcioletnie śledzenie wyników po transplantacji.

Mediana rzeczywistego okresu obserwacji wyniosła 6,04 roku, przy zakresie od 218 dni do 9,01 roku. U 84% uczestników dostępne były co najmniej trzy lata obserwacji.

Pobieranie materiału w kilku punktach czasowych

Próbki od dawców pobierano na sali operacyjnej bezpośrednio przed pobraniem narządu. Pierwszą próbkę od biorcy po transplantacji uzyskiwano w ciągu 60 minut od implantacji i reperfuzji narządu. Kolejne próbki BAL pochodziły z rutynowych bronchoskopii wykonywanych przy wypisie ze szpitala oraz po 6 tygodniach, 3 miesiącach, 6 miesiącach i 12 miesiącach po transplantacji.

Autorzy zaznaczają, że bronchoskopie zaplanowane w ramach nadzoru mogły jednocześnie przypadać na okres występowania zdarzenia klinicznego, a niektóre badania przy wypisie lub w późniejszych terminach były odraczane u stabilnych klinicznie pacjentów.

Analiza mikrobiomu bakteryjnego

Materiał stanowił płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego – bronchoalveolar lavage, BAL. Po odwirowaniu materiału izolowano DNA, a następnie amplifikowano regiony V1–V2 genu bakteryjnego 16S rRNA. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie Illumina MiSeq w pięciu seriach. Do demultipleksowania oraz identyfikacji wariantów sekwencji ampliconowych – ASV – wykorzystano QIIME2.

Autorzy raportują, że sekwencjonowaniu poddano 977 próbek BAL. Analizowano również 214 próbek kontrolnych uzyskanych z płukania bronchoskopów przed zabiegiem oraz 83 kontrole środowiskowe. Po kontroli jakości autorzy raportują 894 próbki o średniej głębokości sekwencjonowania 38 681 odczytów.

Całkowite obciążenie bakteryjne oceniano niezależnie metodą ilościowej reakcji PCR – qPCR – dla genu 16S rRNA. Pozwalało to analizować nie tylko względny udział poszczególnych bakterii, ale również całkowitą zawartość materiału bakteryjnego w próbce.

Analiza cytokin i metabolitów

Próbki BAL pobrane bezpośrednio po implantacji badano przy użyciu wieloparametrowego testu cytokin na platformie Luminex. Wykonywano również ukierunkowaną analizę aminokwasów i kwasów żółciowych metodą LC-MS/MS. Dodatkowo oznaczano pepsynę, pentraxin 3 i aktywność amylazy.

W analizach statystycznych zastosowano m.in. modele proporcjonalnego hazardu Coxa. Jako uzupełnienie wykorzystano elastyczny parametryczny model ryzyk konkurujących, uwzględniający zgon jako zdarzenie konkurujące. W analizach wieloczynnikowych uwzględniano wiek, pierwotną dysfunkcję przeszczepu – PGD, ostre odrzucanie komórkowe – ACR, status CMV oraz liczbę niezgodności HLA.

Jak często rozwijał się CLAD?

Podczas obserwacji CLAD rozwinęło 70 z 186 uczestników, czyli 38%. Mediana czasu do rozwoju CLAD w tej grupie wynosiła 3,04 roku.

W analizie czasu do wystąpienia CLAD starszy wiek był związany z wyższym hazardem zdarzenia – HR 1,04; p=0,007. Istotny był również maksymalny stopień ostrego odrzucania komórkowego – HR 1,4; p=0,026. Nie stwierdzono natomiast istotnego związku czasu do CLAD ze statusem CMV – HR 1,28; p=0,32 – ani z liczbą niezgodności HLA – HR 1,03; p=0,77.

Trzy biologiczne sygnały związane z CLAD

Najważniejszym wynikiem pracy było zidentyfikowanie trzech cech biologicznych, których związki z CLAD były najsilniejsze w różnych momentach po transplantacji. Dane nie wskazują na istnienie jednego stałego profilu mikrobiologicznego charakterystycznego dla wszystkich późniejszych przypadków CLAD.

IP10/CXCL10 bezpośrednio po transplantacji

W panelu cytokin ocenianych w BAL bezpośrednio po implantacji najsilniejszy związek z wcześniejszym rozwojem CLAD stwierdzono dla IP10/CXCL10. Zależność pozostawała istotna po korekcji na wielokrotne porównania – FDR=0,001.

Najsilniejszy sygnał dotyczył uczestników znajdujących się w najwyższym kwartylu stężenia IP10/CXCL10. W tej grupie hazard CLAD był wyższy – HR 1,81; p=0,0016. HR 1,81 oznacza około 81-procentowo wyższy hazard zdarzenia w analizowanym modelu, a nie wzrost bezwzględnego prawdopodobieństwa CLAD o 81 punktów procentowych.

Uzupełniający model parametryczny również potwierdził związek pomiędzy IP10/CXCL10 a CLAD – z=3,36; p<0,001. Różnica pomiędzy grupami była widoczna wcześnie po transplantacji, a następnie malała i po 54 miesiącach nie była już statystycznie istotna. Autorzy wskazują zatem, że stężenie IP10/CXCL10 bezpośrednio po implantacji było przede wszystkim związane z wcześniejszym występowaniem CLAD.

Bezpośrednio po transplantacji stężenie IP10/CXCL10 było również słabo, ale statystycznie istotnie odwrotnie skorelowane ze stosunkiem Streptococcus/Prevotella – współczynnik korelacji Pearsona r=-0,21; p=0,038. Wyższemu stężeniu IP10/CXCL10 towarzyszył zatem profil z większym udziałem Prevotella i mniejszym udziałem Streptococcus.

Ważnym wynikiem negatywnym jest to, że oznaczenie IP10/CXCL10 po 6 tygodniach – czyli w punkcie, w którym stosunek Streptococcus/Prevotella był najsilniej związany z CLAD – nie wykazało związku ani z późniejszym wynikiem klinicznym, ani z tym stosunkiem bakterii.

CXCL10 jest ligandem receptora CXCR3 i silnym chemoatraktantem, którego ekspresja jest typowo stymulowana przez interferon gamma. W badanej kohorcie sam interferon gamma w płucu nie był jednak związany z wynikami dotyczącymi CLAD. Autorzy podkreślają, że mechanizm łączący wczesne podwyższenie CXCL10 z późniejszą dysfunkcją przeszczepu wymaga dalszych badań.

Stosunek Streptococcus do Prevotella po 6 tygodniach

Drugim istotnym sygnałem była relacja pomiędzy względną obfitością bakterii z rodzajów Streptococcus i Prevotella. Największą różnicę pomiędzy osobami, które później rozwinęły CLAD, a osobami pozostającymi bez CLAD stwierdzono w pierwszych 100 dniach, szczególnie 6 tygodni po transplantacji. Dla tego punktu czasowego różnica w stosunku Streptococcus/Prevotella osiągnęła p=0,002.

Wyższy stosunek Streptococcus/Prevotella był związany z dłuższym czasem bez CLAD – HR 0,68; p=0,00065. Uzupełniający model ryzyk konkurujących również potwierdził tę zależność – z=3,21; p=0,001.

Istotne rozdzielenie częstości CLAD pomiędzy osobami z niskim i wysokim stosunkiem Streptococcus/Prevotella obserwowano od 12. miesiąca po transplantacji. Rozdzielenie pomiędzy grupą pośrednią i wysoką było widoczne od około 60. miesiąca.

Autorzy przeprowadzili także analizę poszczególnych rodzajów. Obecność co najmniej jednej próbki w pierwszym roku, w której Streptococcus stanowił ponad 30% względnej obfitości bakterii, była związana z późniejszym wystąpieniem CLAD. W przypadku dużego udziału Prevotella kierunek zależności wskazywał na szybsze występowanie CLAD, ale wynik nie był statystycznie istotny – HR 1,31; p=0,33.

Autorzy rozważają kilka możliwych wyjaśnień biologicznych. Wcześniejsze badania sugerowały, że Streptococcus może być związany z mniej zapalnym środowiskiem immunologicznym niż niektóre inne bakterie dróg oddechowych. Komensalne gatunki Streptococcus mogą również ograniczać podatność na kolonizację lub zakażenie drobnoustrojami bardziej szkodliwymi dla układu oddechowego. Są to jednak hipotezy mechanistyczne, których omawiane badanie obserwacyjne bezpośrednio nie testowało.

Większe obciążenie bakteryjne po 6 miesiącach

Trzecim sygnałem była całkowita ilość bakterii w BAL, szacowana na podstawie liczby kopii genu 16S rRNA metodą qPCR. Obciążenie bakteryjne obejmowało zakres około pięciu rzędów wielkości – od wartości niewykrywalnych, poniżej 10 kopii na µl, do około 10⁵ kopii na µl.

W pierwszych około 100 dniach po transplantacji obciążenie bakteryjne zwiększało się niezależnie od tego, czy u pacjenta później rozwinął się CLAD. Następnie zaczynało spadać, przy czym spadek był większy u osób, które pozostały bez CLAD.

Po 6 miesiącach osoby bez późniejszego CLAD miały niższe obciążenie bakteryjne. Różnica miała nominalne p=0,01, ale po korekcji na wielokrotne porównania FDR wynosił 0,08. Znacznie ważniejszy dla głównego pytania badania był związek z czasem do CLAD: większa liczba bakterii po 6 miesiącach była związana z wcześniejszym wystąpieniem CLAD – HR 1,34; p=0,0025.

Zależność potwierdzono w modelu uwzględniającym konkurujące ryzyko zgonu – z=2,81; p=0,005. Różnica w skumulowanej częstości CLAD pomiędzy grupami o niskim i wysokim obciążeniu bakteryjnym stawała się statystycznie istotna od około 60 miesięcy po transplantacji. Obciążenie bakteryjne w innych analizowanych punktach czasowych nie wykazywało istotnego związku z CLAD.

Nie znaleziono jednego globalnego profilu mikrobiomu CLAD

Ogólny skład mikrobiomu, oceniany za pomocą ważonego dystansu UniFrac, był w większości podobny pomiędzy osobami, które rozwinęły CLAD, a osobami bez CLAD. Autorzy odnotowali jednak nominalnie istotne różnice w próbkach pochodzących od dawców – PERMANOVA p=0,015 – oraz w próbkach pobranych 12 miesięcy po transplantacji – PERMANOVA p=0,013. W tych punktach nie wykryto jednak konkretnych taksonów różniących się istotnie pomiędzy grupami.

Nie stwierdzono związku przyszłego CLAD ze wskaźnikami alfa-różnorodności Chao, Shannon ani Simpson. Odległość składu mikrobiomu biorców od mikrobiomu zdrowych osób kontrolnych również nie była związana z przyszłym wystąpieniem CLAD.

Modelowanie Dirichleta pozwoliło wyróżnić pięć potencjalnych typów społeczności mikrobiologicznych. Jeden z nich był wyraźnie zdominowany przez Pseudomonas, natomiast pozostałe w większym stopniu tworzyły kontinuum różniące się względnym udziałem bakterii typowych dla jamy ustnej i dróg oddechowych. Ani przynależność do określonego typu społeczności, ani przechodzenie pomiędzy tymi typami w kolejnych próbkach nie było związane z przyszłym CLAD.

W tej kohorcie osób bez mukowiscydozy względna obfitość Pseudomonas nie była związana ani z czasem do CLAD, ani z samym wystąpieniem CLAD. W nieukierunkowanej analizie innych taksonów również nie stwierdzono istotnych zależności po korekcji FDR.

Metabolity i markery aspiracji bez potwierdzonego związku

W ukierunkowanej analizie aminokwasów i kwasów żółciowych nie wykazano związku poszczególnych metabolitów z CLAD. Również ogólny skład metabolomiczny oceniany za pomocą dystansu Bray-Curtisa nie różnił się istotnie w zależności od późniejszego wyniku klinicznego – PERMANOVA p=0,238.

Autorzy nie stwierdzili związku wyników dotyczących CLAD ze stężeniem pepsyny, aktywnością amylazy ani stężeniem pentraxin 3 w BAL pobranym bezpośrednio po implantacji. Nie wykazano również związku CLAD ze stężeniem pepsyny po 6 tygodniach.

Połączenie biomarkerów i czynników klinicznych

Badacze sprawdzili następnie, czy trzy zidentyfikowane sygnały biologiczne mogą wspólnie z czynnikami klinicznymi stratyfikować ryzyko późniejszego CLAD.

Do modelu proporcjonalnego hazardu Coxa włączono stężenie IP10/CXCL10 bezpośrednio po transplantacji, stosunek Streptococcus/Prevotella po 6 tygodniach, liczbę kopii bakteryjnego genu 16S rRNA po 6 miesiącach, a także wiek, maksymalny stopień ACR, PGD, status CMV oraz liczbę niezgodności HLA.

W modelu wieloczynnikowym wszystkie trzy parametry biologiczne pozostawały istotnie związane z czasem do CLAD. Dla logarytmu liczby kopii bakteryjnego 16S współczynnik hazardu wynosił 1,279, a dla logarytmu stosunku Streptococcus/Prevotella 0,753. Istotne pozostawały również maksymalny stopień ACR – HR 1,505 – oraz wiek – HR 1,034. Status CMV, PGD i liczba niezgodności HLA nie osiągnęły istotności statystycznej w tym modelu.

Do oszacowania ryzyka zastosowano walidację krzyżową leave-one-out. Przewidywane ryzyko było silnie związane z późniejszym wystąpieniem CLAD – HR 1,25; p=1,74 × 10⁻¹². Po podziale uczestników na grupy wysokiego i niskiego przewidywanego ryzyka hazard CLAD był ponad trzykrotnie większy w grupie wysokiego ryzyka – HR 3,08; p=1,34 × 10⁻⁵.

W tekście wyników autorzy podają skorygowany metodą bootstrap C-index równy 0,6886. Jednocześnie podkreślają, że model został utworzony na podstawie cech wybranych post hoc jako związane z CLAD w tej samej kohorcie. Z tego powodu wymaga on walidacji w niezależnej populacji.

Według analizy wkładu zmiennych największy udział w modelu miały IP10/CXCL10 oraz całkowita zawartość bakterii, a następnie stosunek Streptococcus/Prevotella, ACR i wiek. Mniejszy wkład miały status CMV, PGD oraz liczba niezgodności HLA.

Znaczenie kliniczne i ograniczenia

Jednym z najważniejszych elementów badania jest wyraźna zależność znaczenia poszczególnych markerów od czasu, jaki upłynął od transplantacji. Wyniki nie wskazują na istnienie jednego parametru, którego znaczenie prognostyczne pozostawałoby stałe przez cały okres obserwacji.

IP10/CXCL10 oznaczony bezpośrednio po implantacji był związany przede wszystkim z wcześniejszym CLAD. Skład mikrobiomu, wyrażony stosunkiem Streptococcus/Prevotella około 6. tygodnia, był związany z CLAD pojawiającym się od kolejnych miesięcy obserwacji. Z kolei większe całkowite obciążenie bakteryjne około 6. miesiąca było związane z późniejszym występowaniem CLAD, ze szczególnie widocznym rozdzieleniem grup po około 5 latach.

Autorzy interpretują tę sekwencję jako możliwą wskazówkę, że do CLAD mogą prowadzić różne procesy działające w odmiennych okresach pierwszego roku po transplantacji. Badanie obserwacyjne nie pozwala jednak ustalić, czy IP10/CXCL10, zmiany składu mikrobiomu lub zwiększone obciążenie bakteryjne są przyczynami CLAD, elementami szlaku prowadzącego do uszkodzenia czy jedynie markerami innych procesów biologicznych.

Mocne strony badania

Do mocnych stron autorzy zaliczają dużą jak na badania mikrobiomu po transplantacji płuc kohortę 186 uczestników, długi okres obserwacji przekraczający medianą 6 lat oraz intensywne pobieranie materiału w pierwszym roku po transplantacji. Badanie obejmowało również próbki od dawców i próbki pobierane od biorców już w ciągu 60 minut od implantacji i reperfuzji narządu.

Istotną zaletą było połączenie danych o względnym składzie mikrobiomu z ilościową oceną całkowitego obciążenia bakteryjnego oraz wykorzystanie licznych kontroli technicznych i środowiskowych.

Ograniczenia

Autorzy wskazują, że sekwencjonowanie genu 16S rRNA ma ograniczoną zdolność identyfikowania bakterii na poziomie szczepów i nie pozwala określić pełnej zawartości genowej mikrobiomu.

Nie dysponowano podłużnymi pomiarami cytokin i metabolitów we wszystkich punktach czasowych. Nie było również możliwe wiarygodne określenie stosowanej antybiotykoterapii oraz przestrzegania leczenia na podstawie dostępnej elektronicznej dokumentacji medycznej.

Procedura BAL nie była formalnie wystandaryzowana. Autorzy uznają wprawdzie za mało prawdopodobne, aby różnice w sposobie podawania i odzyskiwania płynu systematycznie różniły grupy CLAD i bez CLAD, ale pozostaje to ograniczeniem metodycznym.

Analiza koncentrowała się na mikrobiomie bakteryjnym. Nie oceniano kompleksowo znaczenia grzybów i wirusów, mimo że mogą one wpływać na uszkodzenie przeszczepionego płuca i rozwój CLAD.

W modelach uwzględniono wiek, PGD, ACR, status CMV i niezgodności HLA, ale nie były kompleksowo dostępne dane dotyczące innych czynników wiązanych z CLAD, takich jak zakażenia wirusowe układu oddechowego, refluks żołądkowo-przełykowy czy przeciwciała swoiste dla dawcy.

Najważniejszym ograniczeniem z punktu widzenia przyszłego zastosowania prognostycznego jest post hoc wybór kluczowych zmiennych związanych z CLAD. Autorzy podkreślają dlatego konieczność niezależnej walidacji modelu.

Badanie Merensteina i współautorów wskazuje więc, że biologiczne środowisko przeszczepionego płuca już w pierwszych tygodniach i miesiącach może być związane z odległym wynikiem transplantacji. Nie zidentyfikowano jednego „mikrobiomu CLAD”. Zamiast tego wykazano trzy czasowo odrębne związki obejmujące IP10/CXCL10, stosunek Streptococcus/Prevotella i całkowite obciążenie bakteryjne. Połączenie tych parametrów z czynnikami klinicznymi umożliwiło w analizowanej kohorcie wyodrębnienie grup różniących się ponad trzykrotnie hazardem CLAD, jednak możliwość wykorzystania tego modelu w praktyce wymaga potwierdzenia w niezależnych populacjach.