G551D i N1303K silniej odpowiadają na połączenie trzech klas potencjatorów CFTR

Połączenie trzech mechanistycznie odmiennych klas potencjatorów CFTR może znacznie zwiększać funkcjonalną korekcję wybranych wariantów związanych z mukowiscydozą. W badaniu opublikowanym 14 sierpnia 2026 r. w npj Drug Discovery efekt ten wykazano m.in. dla G551D, N1303K i W1282X. Najsilniejszą odpowiedź obserwowano dla G551D-CFTR: w modelu 16HBE maksymalny prąd zwarciowy zależny od CFTR osiągał około 185% wartości referencyjnej dla CFTR typu dzikiego, a w pierwotnych komórkach nabłonka nosa od osoby homozygotycznej pod względem G551D około 200% średniej wartości uzyskanej w hodowlach od osób bez mukowiscydozy. Wyniki mają jednak charakter przedkliniczny i nie dowodzą skuteczności ani bezpieczeństwa takiej strategii terapeutycznej u pacjentów.

Dlaczego trzy klasy potencjatorów mogą działać addytywnie?

Mukowiscydoza jest chorobą spowodowaną chorobotwórczymi wariantami genu CFTR. Kodowane przez ten gen białko CFTR jest kanałem anionowym obecnym w błonie apikalnej nabłonków wydzielniczych, którego aktywność zależy m.in. od fosforylacji za pośrednictwem kinazy białkowej A. Poszczególne warianty mogą prowadzić do różnych zaburzeń, obejmujących m.in. syntezę białka, jego fałdowanie i przetwarzanie, transport do błony komórkowej, bramkowanie kanału, przewodnictwo oraz stabilność białka w błonie.

Modulatory CFTR pozwoliły przywracać część funkcji nieprawidłowego białka u wielu osób z mukowiscydozą. Korektory przede wszystkim zwiększają ilość odpowiednio przetworzonego CFTR docierającego do błony komórkowej, natomiast potencjatory zwiększają aktywność kanałów obecnych już w błonie.

Autorzy omawianej publikacji wskazują, że spośród około 1200 wariantów sklasyfikowanych w CFTR2 jako chorobotwórcze około 300 było w momencie przygotowania pracy objętych amerykańską rejestracją FDA dla terapii Trikafta. Przywołują również wcześniejszą analizę 655 chorobotwórczych wariantów CFTR, w której ponad 30% sklasyfikowano jako nieodpowiadające lub odpowiadające granicznie na kombinację elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor.

Kombinacja określana w Stanach Zjednoczonych jako Trikafta obejmuje tezakaftor VX-661, iwakaftor VX-770 oraz elexakaftor VX-445. VX-445 ma przy tym podwójne działanie: jest korektorem, ale wykazuje również aktywność potencjatora CFTR.

Wcześniejsze badania pozwoliły wyróżnić potencjatory podobne funkcjonalnie do VX-770 oraz tak zwane ko-potencjatory, takie jak apigenina i bisdemetoksykurkumina, oznaczana jako bDMC. Nowa praca dostarcza argumentów, że VX-445 może tworzyć trzecią, funkcjonalnie odrębną klasę potencjatorów.

Autorzy przeanalizowali profile działania potencjatorów dla wariantów R352Q, S549R, S549N, W1282X i N1303K. VX-770 i ABBV-974 grupowały się razem, podobnie jak ko-potencjatory bDMC i apigenina. VX-445 tworzył natomiast odrębną kategorię. Obserwacja ta jest zgodna z danymi strukturalnymi wskazującymi na inne miejsca wiązania VX-445 i VX-770 w białku CFTR.

Jak zaprojektowano badanie?

Badanie przeprowadził międzynarodowy zespół: Guido Veit, Christian Vaccarin, Márton A. Simon, Haijin Xu, Houriyeh Hajizadeh, Tina He, Adriana Chilin, Elias Matouk, László Csanády, Giovanni Marzaro i Gergely L. Lukacs.

Autorzy reprezentowali m.in. Department of Physiology, McGill University; Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova; Department of Biochemistry, Semmelweis University; HUN-REN-SE Ion Channel Research Group; Adult Cystic Fibrosis Clinic, Montreal Chest Institute, McGill University; Department of Diagnostics and Public Health, University of Verona oraz Department of Biochemistry, McGill University.

Projekt obejmował kilka uzupełniających się modeli eksperymentalnych. Wykorzystano komórki CFBE41o- z indukowaną ekspresją wariantów CFTR, a także komórki 16HBE14o- po edycji genowej, zawierające warianty G551D, W1282X lub N1303K. W badaniach zastosowano również pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa HNE.

HNE hodowano na granicy powietrze–ciecz przez około trzy tygodnie. Funkcję CFTR oceniano m.in. za pomocą pomiarów prądu zwarciowego I_sc w komorach Ussinga. W komórkach CFBE41o- wykorzystywano również test wygaszania fluorescencji YFP wrażliwego na halogenki.

Dodatkowo przeprowadzono elektrofizjologiczne pomiary pojedynczych kanałów G551D-CFTR w konfiguracji inside-out patch clamp w komórkach HEK-293T. Pozwoliło to sprawdzić, czy addytywne działanie kolejnych potencjatorów można wykazać bezpośrednio na poziomie prawdopodobieństwa otwarcia pojedynczego kanału.

Istotnym ograniczeniem interpretacyjnym jest liczebność materiału biologicznego w części doświadczeń HNE. Kluczowe hodowle homozygotyczne dla G551D, W1282X i N1303K pochodziły od pojedynczych osób. Wartości oznaczone w części doświadczeń jako n = 3 odnosiły się do pomiarów eksperymentalnych, a nie do trzech niezależnych pacjentów.

G551D: bardzo silna odpowiedź na potrójną potencjację

G551D jest wariantem powodującym ciężki defekt bramkowania CFTR. Kanał może być obecny w błonie komórkowej, ale jego prawdopodobieństwo otwarcia pozostaje bardzo małe.

W komórkach 16HBE po edycji genowej odpowiedź G551D-CFTR na samą forskolinę była minimalna w porównaniu z CFTR typu dzikiego. Badacze następnie kolejno dodawali VX-770, VX-445 oraz apigeninę.

Kolejne potencjatory zwiększały prąd związany z G551D-CFTR. Ich względny udział w maksymalnej odpowiedzi I_sc wynosił około 27% dla VX-770, 40% dla VX-445 i 28% dla apigeniny. Kolejność podania VX-445 i apigeniny jako drugiego i trzeciego potencjatora nie wpływała istotnie na końcową maksymalną wartość prądu.

Po potrójnej potencjacji maksymalny prąd G551D-CFTR osiągał około 185% prądu uzyskiwanego po stymulacji forskoliną w rodzicielskich komórkach 16HBE z CFTR typu dzikiego. Nie należy interpretować tej wartości jako informacji, że każdy pojedynczy kanał G551D przewodził 1,85 raza więcej jonów niż pojedynczy kanał WT. Jest to wartość znormalizowanego prądu makroskopowego w określonym modelu eksperymentalnym.

Autorzy sprawdzili, czy tak duży prąd mógł wynikać wyłącznie z większej ilości białka G551D-CFTR. Analiza immunoblot wykazała, że ilość dojrzałej, kompleksowo glikozylowanej formy G551D-CFTR, odpowiadającej pasmu C, wynosiła około 125% ilości stwierdzanej dla CFTR typu dzikiego. Różnica w ilości białka była więc mniejsza niż różnica w wielkości prądu, co wspiera interpretację wskazującą na silną aktywację bramkowania kanału.

Na podstawie danych makroskopowych i względnej ilości białka autorzy oszacowali, że prawdopodobieństwo otwarcia P_o potrójnie potencjowanego G551D-CFTR mogło wynosić około 0,56–0,64. Wartość ta nie pochodziła z bezpośredniego pomiaru pojedynczego kanału. Dla porównania we wcześniejszych badaniach P_o CFTR typu dzikiego oszacowano na około 0,43 w kanałach rekonstytuowanych w dwuwarstwie lipidowej oraz około 0,38 w wyciętych fragmentach błony.

W pierwotnych HNE uzyskanych od jednej osoby homozygotycznej pod względem G551D potrójna potencjacja doprowadziła do maksymalnego I_sc odpowiadającego około 200% średniego prądu indukowanego forskoliną w HNE pochodzących od 10 osób bez mukowiscydozy. Względny udział VX-770, VX-445 i apigeniny wynosił odpowiednio około 24%, 56% i 20%.

Dodatkowe hodowle HNE pochodzące od osób heterozygotycznych złożonych, posiadających jeden allel G551D i drugi allel Y1092X lub F508del, również osiągały po potrójnej potencjacji odpowiedź przekraczającą poziom referencyjny WT.

Bezpośrednie pomiary pojedynczego kanału

W eksperymentach inside-out patch clamp wyjściowe prawdopodobieństwo otwarcia G551D-CFTR wynosiło około 0,006. Po kolejnym dodaniu VX-770 wzrosło do około 0,026, po dodaniu VX-445 do 0,103, a po dodaniu apigeniny do 0,166.

Wartości te są niższe niż P_o oszacowane z pomiarów makroskopowych. Autorzy wskazują dwa możliwe wyjaśnienia: doświadczenia na pojedynczych kanałach prowadzono w temperaturze 25°C, a nie 37°C, a ponadto heterologiczny system HEK-293T może różnić się od komórek nabłonkowych pod względem modyfikacji potranslacyjnych CFTR.

Interakcje między klasami potencjatorów

Obecność VX-770 nie zmieniała istotnie EC₅₀ VX-445. Wartość EC₅₀ dla aktywacji G551D-CFTR przez VX-445 wynosiła 2,3 ± 0,6 nM bez VX-770 i 2,5 ± 0,2 nM w jego obecności.

Inny efekt stwierdzono dla apigeniny. Jej EC₅₀ wynosiło 347 ± 55 µM, natomiast w obecności VX-770 zmniejszało się do 106 ± 11 µM, a w obecności VX-445 do 56 ± 1 µM. Wynik wskazuje na zwiększenie pozornej siły działania apigeniny w obecności pozostałych potencjatorów i jest zgodny z hipotezą o allosterycznych zależnościach między mechanizmami regulującymi bramkowanie CFTR.

N1303K i W1282X: zwiększenie funkcjonalnej korekcji

N1303K-CFTR

N1303K powoduje złożone zaburzenia obejmujące przetwarzanie CFTR, transport białka do powierzchni komórki oraz bramkowanie kanału. Wcześniejsze kombinacje modulatorów przywracały jego funkcję jedynie częściowo.

W komórkach 16HBEge, w których N1303K-CFTR wcześniej poddano korekcji za pomocą VX-661, ostre zastosowanie VX-770, VX-445 i apigeniny zwiększyło prąd CFTR do wartości przekraczającej 100% poziomu WT. Względny udział prądów wywołanych przez VX-770, VX-445 i apigeninę wynosił odpowiednio około 8%, 44% i 46%.

W pierwotnych HNE pochodzących od jednej osoby homozygotycznej pod względem N1303K maksymalna funkcjonalna korekcja była mniejsza i osiągnęła około 45% referencyjnego I_sc dla WT. Względny udział odpowiedzi wywołanej przez VX-770, VX-445 i apigeninę wynosił odpowiednio około 1%, 34% i 46%; pozostałą część stanowiła odpowiedź obecna przed podaniem tych potencjatorów.

W dyskusji autorzy zwracają uwagę, że w tym modelu HNE dołączenie ko-potencjatora zwiększało prąd z około 20% do ponad 40% poziomu WT. Na tej podstawie postulują, że trzeci mechanizm potencjacji może istotnie uzupełniać działanie VX-770 i VX-445 w N1303K-CFTR.

W1282X-CFTR

W1282X jest wariantem nonsensownym wprowadzającym przedwczesny kodon terminacyjny. Powstały transkrypt jest podatny na mechanizm nonsense-mediated decay – NMD. Według danych przywołanych przez autorów prowadzi to do zmniejszenia ilości mRNA CFTR o ponad 70%.

W przypadku W1282X problemem nie jest więc wyłącznie nieprawidłowe bramkowanie. Ilość transkryptu i skróconego białka dostępnego dla korektorów i potencjatorów jest znacznie ograniczona.

W komórkach 16HBEge, gdy VX-661 stosowano jako korektor, a VX-770, VX-445 i apigeninę jako potencjatory, funkcjonalna korekcja osiągała około 11% prądu fosforylowanego CFTR typu dzikiego.

Gdy VX-445 wykorzystano zarówno jako korektor, jak i potencjator, razem z VX-661 jako drugim korektorem oraz VX-770 i apigeniną jako ostrymi potencjatorami, wartość wzrosła do około 14% prądu WT.

W pierwotnych HNE od jednej osoby homozygotycznej pod względem W1282X konieczne było częściowe zahamowanie NMD inhibitorem SMG1, aby zwiększyć małą wyjściową ilość mRNA W1282X-CFTR. Po 24-godzinnej ekspozycji na inhibitor SMG1, VX-661 i VX-445 oraz ostrym zastosowaniu VX-770 i apigeniny uzyskano I_sc odpowiadający około 9% wartości WT.

Nowe ko-potencjatory ML-014 i ML-051

Apigenina była użytecznym związkiem doświadczalnym pozwalającym wykazać koncepcję trzeciej klasy potencjacji, jednak jej mała siła działania i ograniczona biodostępność utrudniają rozważanie jej jako praktycznego kandydata terapeutycznego. Autorzy rozpoczęli więc poszukiwanie związków o korzystniejszych właściwościach.

Punktem wyjścia był wcześniej opisany związek 4172. W toku badań zidentyfikowano ML-014, który nie wykazywał znaczącej aktywności korektora, lecz działał jako potencjator G551D- i N1303K-CFTR w połączeniu z VX-770 i VX-445.

ML-014 poddano następnie szerokiej optymalizacji chemicznej. Analiza biblioteki około 70 związków pozwoliła określić zależności struktura–aktywność oraz wyłonić ulepszone analogi, m.in. ML-051, ML-054, ML-069 i ML-070.

W komórkach 16HBEge ML-051, zastosowany jako trzeci potencjator po VX-770 i VX-445, zwiększał aktywność fosforylowanego N1303K-CFTR o wartość odpowiadającą około 25% poziomu WT. EC₅₀ znajdowało się w zakresie submikromolarnym.

W pierwotnych HNE homozygotycznych pod względem N1303K wybrane analogi ML-014 zwiększały prąd o wartość odpowiadającą około 11–15% prądu WT.

ML-051 zwiększał również funkcjonalną korekcję S549R-CFTR i I507del-CFTR w komórkach CFBE41o- leczonych przez 24 godziny VX-661 i VX-445, a następnie poddawanych ostrej ekspozycji na VX-770. Są to jednak nadal wyniki przedkliniczne.

Wstępne dane farmakokinetyczne

ML-014, ML-051, ML-054, ML-069 i ML-070 poddano wstępnej ocenie farmakokinetycznej. Wszystkie związki charakteryzowały się małą rozpuszczalnością w wodzie oraz wiązaniem z białkami osocza przekraczającym 99%.

ML-014, ML-054 i ML-070 były stabilne w ludzkich mikrosomach wątrobowych. Ich klirens wewnętrzny wynosił mniej niż 10 µl/min/mg białka, a okresy półtrwania w tym układzie wynosiły odpowiednio około 300, 160 i 340 minut.

Dla ML-014 przeprowadzono również badanie farmakokinetyczne in vivo u myszy. Po dożylnym podaniu 2,5 mg/kg C_max wynosiło 3447 ng/ml, a związek pozostawał oznaczalny w osoczu po 24 godzinach. Średni czas przebywania wynosił 337 minut, a okres półtrwania 252 minuty.

Po doustnym podaniu 30 mg/kg T_max wynosił 6 godzin, a stężenie w tym punkcie 11 368 ng/ml. Biodostępność doustną oszacowano na 33%. Wynik ten dotyczy myszy i nie pozwala przewidywać biodostępności ani dawkowania u ludzi.

Znaczenie wyników i ograniczenia badania

Praca wskazuje, że w części wariantów CFTR z istotnym defektem bramkowania zastosowanie dwóch potencjatorów nie musi wykorzystywać całego możliwego zakresu aktywacji kanału. Trzeci związek działający poprzez funkcjonalnie odmienny mechanizm może dodatkowo zwiększać prawdopodobieństwo otwarcia kanału.

Najbardziej spójne dane mechanistyczne uzyskano dla G551D. Addytywne działanie kolejnych potencjatorów obserwowano w komórkach 16HBE po edycji genowej, pierwotnych HNE oraz w pomiarach pojedynczych kanałów. Dla N1303K również uzyskano wyraźny wzrost funkcji po dodaniu trzeciego potencjatora.

Jednocześnie wyników nie można bezpośrednio przeliczać na poprawę FEV₁, stężenie chlorków w pocie, częstość zaostrzeń, liczbę hospitalizacji ani jakość życia. Badanie nie było próbą kliniczną i nie oceniano w nim żadnego z tych punktów końcowych.

Szczególnej ostrożności wymaga interpretacja wartości przekraczających 100% poziomu WT. Są to wyniki określonych testów laboratoryjnych, znormalizowane względem odpowiedzi referencyjnej. Nie oznaczają, że osoba z mukowiscydozą uzyskałaby „200% prawidłowej funkcji CFTR” ani że efekt kliniczny byłby proporcjonalny do wartości zmierzonej w komórkach.

Autorzy proponują, że rozwój silniejszych i farmakologicznie bardziej użytecznych ko-potencjatorów może w przyszłości zwiększyć możliwości funkcjonalnej korekcji niektórych wariantów CFTR. Zanim koncepcja mogłaby zostać wykorzystana klinicznie, potrzebne są dalsze badania farmakologiczne i toksykologiczne oraz – dla odpowiednich kandydatów – badania kliniczne oceniające bezpieczeństwo i rzeczywistą korzyść dla pacjentów.

Badania wykorzystujące ludzkie komórki HNE prowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską, na podstawie protokołu i formularza zgody zatwierdzonych przez McGill University Health Centre Research Ethics Board. Autorzy zadeklarowali brak konkurencyjnych interesów.