Stabilizacja mikrotubul może utrudniać Pseudomonas aeruginosa kolonizację nabłonka w mukowiscydozie

Pseudomonas aeruginosa pozostaje jednym z najważniejszych patogenów związanych z przewlekłymi zakażeniami dróg oddechowych u osób z mukowiscydozą. Nowe badanie opublikowane w Infection and Immunity wskazuje, że jednym z mechanizmów sprzyjających kontaktowi bakterii z nabłonkiem może być zaburzona stabilność mikrotubul zależna od nadmiernej aktywności deacetylazy histonowej 6 (HDAC6). W modelach komórkowych mukowiscydozy zahamowanie HDAC6 stabilizowało mikrotubule i wyraźnie ograniczało zarówno przyleganie P. aeruginosa do komórek nabłonka, jak i – w mniejszym stopniu – internalizację bakterii.

Dlaczego Pseudomonas aeruginosa tak łatwo kolonizuje drogi oddechowe w mukowiscydozie?

Mukowiscydoza jest chorobą uwarunkowaną genetycznie, w której zaburzenie funkcji CFTR prowadzi między innymi do zmian składu i właściwości wydzieliny pokrywającej nabłonek dróg oddechowych oraz do upośledzenia oczyszczania śluzowo-rzęskowego. Powstające środowisko sprzyja utrzymywaniu się drobnoustrojów, w tym Pseudomonas aeruginosa.

Wprowadzenie wysoko skutecznych modulatorów CFTR, w tym terapii zawierających eleksakaftor, tezakaftor i iwakaftor, istotnie zmieniło przebieg mukowiscydozy. Nie oznacza to jednak całkowitego rozwiązania problemu zakażeń dróg oddechowych. Autorzy publikacji zwracają uwagę, że mimo poprawy funkcji CFTR oraz zmniejszenia obciążenia dróg oddechowych wydzieliną u części chorych nadal utrzymują się patogeny, w tym P. aeruginosa. Sugeruje to, że sama nieprawidłowa konsystencja śluzu nie wyjaśnia całej podatności nabłonka osób z mukowiscydozą na kolonizację bakteryjną.

Zespół Kathleen L. Boyne skoncentrował się dlatego na mechanizmie związanym z cytoszkieletem komórki, a dokładniej ze stabilnością mikrotubul regulowaną przez HDAC6.

HDAC6 i mikrotubule – możliwy mechanizm podatności nabłonka

HDAC6 jest przede wszystkim cytoplazmatyczną deacetylazą oddziałującą między innymi na α-tubulinę – jeden z podstawowych składników mikrotubul. Zwiększona aktywność HDAC6 zmniejsza acetylację α-tubuliny, co wiąże się z ograniczeniem stabilności mikrotubul.

Ma to znaczenie znacznie wykraczające poza samą architekturę komórki. Mikrotubule uczestniczą w transporcie wewnątrzkomórkowym, przemieszczaniu pęcherzyków, utrzymywaniu polarności nabłonka oraz dostarczaniu i usuwaniu białek błonowych. Zaburzenia ich dynamiki mogą więc wpływać na to, jakie receptory znajdują się na powierzchni komórki i w których obszarach błony są eksponowane.

Autorzy podkreślają, że wcześniejsze badania wskazywały już na zwiększoną aktywność HDAC6 oraz zmniejszoną acetylację mikrotubul w komórkach nabłonkowych w mukowiscydozie. Nie było jednak jasne, czy zaburzenia te bezpośrednio wpływają na przyleganie i internalizację P. aeruginosa.

Autorzy i ośrodki badawcze

Pracę przygotował zespół, w którego skład weszli między innymi Kathleen L. Boyne, Conor Broeking, Mark Blackstone, Sruthi Singaraju, Thomas J. Kelley, Deborah A. Corey oraz Patrick C. Seed.

Badacze reprezentowali kilka amerykańskich ośrodków naukowych i klinicznych, przede wszystkim Department of Pediatrics, Division of Pulmonary and Sleep Medicine, Ann & Robert H. Lurie Children’s Hospital of Chicago, Northwestern University, Feinberg School of Medicine, Stanley Manne Children’s Research Institute, Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University oraz Department of Pediatrics, Division of Infectious Diseases, Ann & Robert H. Lurie Children’s Hospital of Chicago, Northwestern University, Feinberg School of Medicine.

Badanie zostało opublikowane w czasopiśmie Infection and Immunity. Pierwszą autorką i autorką korespondencyjną publikacji jest Kathleen L. Boyne.

Jak przeprowadzono badanie?

Naukowcy wykorzystali kilka wzajemnie uzupełniających się modeli, aby ocenić, czy zależna od HDAC6 destabilizacja mikrotubul wpływa na interakcję P. aeruginosa z nabłonkiem.

Mysie komórki nabłonka

Badano pierwotne mysie komórki nabłonka nosa pochodzące między innymi od zwierząt typu dzikiego, myszy z mutacją Cftr F508del/F508del, myszy pozbawionych HDAC6, zwierząt z mukowiscydozą pozbawionych jednocześnie HDAC6 oraz myszy pozbawionych TPPP – białka uczestniczącego w stabilizacji mikrotubul.

Komórki hodowano w warunkach ALI, pozwalających na ich różnicowanie i polaryzację oraz bardziej zbliżone do fizjologicznego odwzorowanie nabłonka dróg oddechowych.

Ludzkie modele nabłonkowe

Autorzy wykorzystali także pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa oraz linie komórek nabłonka oskrzeli: 16HBE14o− jako model kontrolny z prawidłowym CFTR oraz CFBE41o− jako model nabłonka związanego z mukowiscydozą.

Szczepy Pseudomonas aeruginosa

W eksperymentach zastosowano między innymi kliniczny izolat P. aeruginosa PA-C073A pochodzący z mukowiscydozy oraz laboratoryjny szczep PA14. W dodatkowych doświadczeniach wykorzystano mutant pscD pozbawiony funkcjonalnego systemu sekrecji typu III. Pozwoliło to sprawdzić, czy działanie związane z HDAC6 zależy wyłącznie od tego bakteryjnego mechanizmu wirulencji.

Farmakologiczne manipulowanie mikrotubulami

Do selektywnego hamowania HDAC6 zastosowano tubastatynę w stężeniu 10 µM przez 24 godziny. Autorzy wykorzystali również nocodazol, który zaburza polimeryzację mikrotubul. Takie zestawienie umożliwiało sprawdzenie, czy korzystny efekt zahamowania HDAC6 rzeczywiście jest związany ze stabilnością mikrotubul.

W teście adhezji komórki eksponowano na bakterie przez 30 minut. Internalizację oceniano po dłuższej ekspozycji, a następnie stosowano gentamycynę w celu eliminacji bakterii pozostających poza komórkami.

Hamowanie HDAC6 zmniejszało przyleganie Pseudomonas aeruginosa

Jednym z najbardziej jednoznacznych wyników było zwiększone przyleganie bakterii do komórek nabłonkowych pochodzących z modeli mukowiscydozy. W przypadku klinicznego izolatu PA-C073A do komórek mysich typu dzikiego przylegało 30,3% podanego inokulum, podczas gdy w komórkach z mukowiscydozą wartość ta wynosiła 38,9%.

Po zastosowaniu tubastatyny odsetek przylegających bakterii zmniejszył się do 24,6% w komórkach typu dzikiego oraz do 28,8% w komórkach z mukowiscydozą.

Bardzo podobny obraz uzyskano dla laboratoryjnego szczepu PA14. Bez leczenia przylegało 32,3% inokulum w komórkach typu dzikiego i 40,6% w komórkach z mukowiscydozą. Po zahamowaniu HDAC6 wartości spadały odpowiednio do 26,2% i 32,6%.

Na rycinie 1 publikacji autorzy pokazali nie tylko zmniejszenie adhezji obu szczepów po zastosowaniu tubastatyny, ale również efekt przeciwny po destabilizacji mikrotubul nocodazolem. Nocodazol zwiększał przyleganie bakterii i w znacznym stopniu znosił działanie tubastatyny. Wynik ten stanowi istotny argument za tym, że obserwowany efekt HDAC6 jest związany właśnie z regulacją mikrotubul.

System sekrecji typu III nie wyjaśniał całego zjawiska

P. aeruginosa wykorzystuje system sekrecji typu III do wprowadzania do komórek gospodarza efektorów wirulencji, które mogą wpływać między innymi na cytoszkielet. Aby sprawdzić, czy obserwowane działanie tubastatyny zależy od tego mechanizmu, badacze wykorzystali mutant pscD pozbawiony funkcjonalnego T3SS.

Tubastatyna nadal ograniczała przyleganie bakterii. W przypadku mutanta pscD różnica osiągnęła istotność statystyczną, co wskazuje, że efekt zahamowania HDAC6 nie może zostać wyjaśniony wyłącznie działaniem bakteryjnego systemu sekrecji typu III.

Genetyczne usunięcie HDAC6 dało podobny efekt

Dodatkowego potwierdzenia dostarczyły modele genetyczne. W mysich komórkach nabłonkowych z mukowiscydozą do powierzchni przylegało 41,8% inokulum PA-C073A. U zwierząt z mukowiscydozą, u których jednocześnie usunięto gen Hdac6, wartość ta spadała do 35,2%.

Western blot potwierdził jednocześnie zwiększoną ilość acetylowanej α-tubuliny w komórkach pozbawionych HDAC6, szczególnie wyraźną w modelu mukowiscydozy z delecją Hdac6. Jest to zgodne z proponowanym mechanizmem – utrata HDAC6 zwiększa acetylację α-tubuliny i sprzyja stabilizacji mikrotubul.

Destabilizacja mikrotubul naśladowała fenotyp mukowiscydozy

Szczególnie interesujący był eksperyment z TPPP. Jest to białko wspierające polimeryzację i stabilność mikrotubul. Po jego genetycznym usunięciu przyleganie PA-C073A wzrosło z 33,9% w komórkach typu dzikiego do 37,7%. Wynik zbliżał się więc w kierunku fenotypu obserwowanego w mukowiscydozie, gdzie w tej serii eksperymentów przylegało 43,3% bakterii.

HDAC6 wpływał również na internalizację bakterii

Autorzy ocenili także, jaka część bakterii, które związały się z komórkami, następnie przedostawała się do ich wnętrza. W tym przypadku różnice pomiędzy mukowiscydozą a modelem kontrolnym również były wyraźne.

Dla klinicznego izolatu PA-C073A internalizacji ulegało 9,6% bakterii związanych z komórkami typu dzikiego oraz 15,5% bakterii związanych z komórkami z mukowiscydozą. Po zastosowaniu tubastatyny w komórkach z mukowiscydozą wartość spadała do 11,7%.

Dla szczepu PA14 internalizacja wynosiła odpowiednio 10,1% w komórkach typu dzikiego i 15,2% w komórkach z mukowiscydozą. Po zahamowaniu HDAC6 w komórkach CF spadała do 12,6%.

Efekt dotyczący internalizacji był więc widoczny, ale słabszy niż wpływ na samą adhezję. Autorzy interpretują to jako wskazówkę, że HDAC6 może odgrywać szczególnie istotną rolę w bardzo wczesnym etapie kontaktu bakterii z powierzchnią nabłonka.

Wyniki potwierdzono w ludzkich komórkach nabłonka

Istotnym elementem pracy było sprawdzenie, czy obserwacje uzyskane w mysich komórkach nabłonkowych można odtworzyć także w modelach ludzkich.

W linii CFBE41o− reprezentującej nabłonek związany z mukowiscydozą autorzy zaobserwowali większe przyleganie klinicznego izolatu PA-C073A niż w komórkach kontrolnych 16HBE14o−. Zastosowanie tubastatyny istotnie ograniczało adhezję bakterii.

Analogiczny wynik uzyskano w pierwotnych ludzkich komórkach nabłonka nosa. Komórki pochodzące z mukowiscydozy wykazywały większe wyjściowe przyleganie bakterii niż komórki bez mukowiscydozy. Po zahamowaniu HDAC6 poziom adhezji w komórkach CF zmniejszał się do wartości zbliżonych do obserwowanych w komórkach kontrolnych.

Na rycinie 4 publikacji autorzy przedstawili również obrazowanie konfokalne pierwotnych ludzkich komórek nabłonka nosa. W preparatach po zastosowaniu tubastatyny widoczne było zwiększenie sygnału acetylowanej α-tubuliny oraz mniejsza obecność P. aeruginosa na powierzchni hodowli, co wizualnie wspierało wyniki ilościowych testów adhezji.

Co wyniki mogą oznaczać dla mukowiscydozy?

Przyleganie bakterii do nabłonka jest jednym z pierwszych etapów prowadzących do kolonizacji dróg oddechowych. Jeżeli mikroorganizmowi uda się skutecznie związać z powierzchnią komórek gospodarza, może następnie rozwijać bardziej trwałe interakcje, wykorzystywać mechanizmy wirulencji i uczestniczyć w powstawaniu struktur o charakterze biofilmowym.

Autorzy proponują, że zwiększona aktywność HDAC6 w mukowiscydozie może tworzyć warunki ułatwiające ten pierwszy etap poprzez destabilizację mikrotubul, zaburzenie organizacji powierzchni nabłonka, jego polarności oraz transportu receptorów i innych białek błonowych.

Zahamowanie HDAC6 mogłoby teoretycznie działać jako terapia ukierunkowana na gospodarza, a nie bezpośrednio na bakterię. Zamiast zabijać P. aeruginosa, zmieniałoby właściwości komórek nabłonkowych w sposób utrudniający bakterii przyczepienie się do ich powierzchni.

Możliwy wpływ na etap poprzedzający rozwój przewlekłego zakażenia

Autorzy zwracają uwagę, że ograniczenie początkowej adhezji mogłoby potencjalnie zmniejszać prawdopodobieństwo kolejnych etapów kolonizacji, w tym tworzenia przewlekłych populacji bakterii i struktur biofilmowych. Jest to jednak hipoteza wymagająca dalszego potwierdzenia w modelach bardziej zbliżonych do organizmu człowieka, a następnie w badaniach klinicznych.

Interesującym kontekstem są również wcześniejsze obserwacje, zgodnie z którymi zahamowanie HDAC6 może oddziaływać nie tylko na komórki gospodarza. Autorzy przywołują badania wskazujące, że bezpośrednia ekspozycja P. aeruginosa na selektywny inhibitor HDAC6 wiązała się ze zmniejszeniem ruchliwości typu swarming oraz tworzenia biofilmu. Potencjalny efekt takiej strategii może być więc bardziej złożony, choć obecne badanie koncentrowało się przede wszystkim na odpowiedzi nabłonka.

Dlaczego wyniki są interesujące również w erze modulatorów CFTR?

Modulatory CFTR korygują podstawowy defekt odpowiedzialny za znaczną część patologii mukowiscydozy, ale u części osób przewlekłe zakażenia dróg oddechowych mogą utrzymywać się mimo poprawy funkcji CFTR. Badanie Boyne i wsp. wskazuje na dodatkowy poziom regulacji podatności na zakażenie – stan cytoszkieletu i organizację powierzchni nabłonka.

Nie oznacza to, że HDAC6 zastępuje CFTR jako podstawowy mechanizm choroby. Wyniki sugerują raczej, że konsekwencje zaburzeń CFTR mogą obejmować wtórne nieprawidłowości komórkowe, które pozostają istotne dla kontaktu gospodarza z drobnoustrojami.

Z perspektywy badań nad mukowiscydozą jest to szczególnie interesujące, ponieważ potencjalna terapia skierowana przeciwko HDAC6 mogłaby – jeśli jej skuteczność i bezpieczeństwo zostaną potwierdzone – uzupełniać modulatory CFTR oraz leczenie przeciwbakteryjne zamiast z nimi konkurować.

Ograniczenia badania

Autorzy zwracają również uwagę na pozornie nieoczekiwany wynik: sama delecja HDAC6 u myszy bez mukowiscydozy powodowała niewielki wzrost przylegania bakterii w porównaniu z komórkami typu dzikiego. Według badaczy może mieć to związek ze zwiększoną odpowiedzią zapalną i uszkodzeniem nabłonka opisywanymi wcześniej w modelach całkowicie pozbawionych HDAC6. Pokazuje to, że biologiczna rola tego enzymu jest złożona i nie można zakładać, że jego zahamowanie będzie korzystne w każdym kontekście.

Wnioski

Badanie Boyne i wsp. wskazuje, że zaburzona dynamika mikrotubul może być jednym z elementów zwiększających podatność nabłonka dróg oddechowych w mukowiscydozie na kolonizację przez Pseudomonas aeruginosa. Zwiększona aktywność HDAC6 prowadząca do zmniejszonej acetylacji α-tubuliny i destabilizacji mikrotubul może sprzyjać przyleganiu bakterii do powierzchni komórki.

Zahamowanie HDAC6 tubastatyną, a także genetyczne usunięcie HDAC6, ograniczały przede wszystkim adhezję P. aeruginosa, a w mniejszym stopniu również jej internalizację. Efekt obserwowano w kilku modelach, w tym w pierwotnych ludzkich komórkach nabłonka nosa.

Wyniki wskazują tym samym na możliwość rozwijania strategii terapeutycznych skierowanych na komórkę gospodarza i stabilność jej cytoszkieletu. Na obecnym etapie pozostaje to jednak koncepcją przedkliniczną. Konieczne są dalsze badania mechanistyczne, modele organoidowe i badania in vivo pozwalające ocenić wpływ hamowania HDAC6 na rzeczywistą kolonizację i eliminację bakterii, odpowiedź immunologiczną oraz bezpieczeństwo terapii.