Poznano genom grzyba Trichosporon asahii wyizolowanego od pacjenta z mukowiscydozą

Naukowcy z Oklahoma State University opisali szkic genomu szczepu Trichosporon asahii OK01, wyizolowanego z plwociny dorosłego pacjenta z mukowiscydozą. Udostępnienie danych genomowych może ułatwić przyszłe badania nad identyfikacją, zmiennością genetyczną i potencjalnym znaczeniem klinicznym grzybów z rodzaju Trichosporon w chorobach układu oddechowego. Publikacja nie rozstrzyga jednak, czy obecność badanego izolatu oznaczała kolonizację, czy aktywne zakażenie.

Znaczenie Trichosporon w mukowiscydozie

Mukowiscydoza jest chorobą genetyczną, w której zaburzenie transportu jonów przez białko CFTR prowadzi między innymi do powstawania gęstej wydzieliny w drogach oddechowych, upośledzenia oczyszczania śluzowo-rzęskowego oraz podatności na przewlekłe zakażenia. W badaniach mikrobiologicznych materiału z dróg oddechowych pacjentów identyfikuje się przede wszystkim bakterie, ale istotną część mikrobiomu i mykobiomu stanowią również grzyby.

Autorzy publikacji zwracają uwagę, że w ostatnich latach w plwocinie osób z mukowiscydozą coraz częściej wykrywane są drobnoustroje wcześniej uznawane za rzadkie lub niedostatecznie poznane. Do tej grupy należą grzyby drożdżopodobne z rodzaju Trichosporon. Niektóre gatunki mogą wywoływać zakażenia miejscowe oraz rozsiane, szczególnie u osób z zaburzeniami odporności lub ciężkimi chorobami współistniejącymi.

Znaczenie kliniczne wykrycia Trichosporon w drogach oddechowych pacjenta z mukowiscydozą nie jest jednak jednoznaczne. W cytowanych przez autorów wcześniejszych opisach przypadków i analizach kohortowych obecność tych grzybów wiązano niekiedy z pogorszeniem stanu układu oddechowego lub ciężkimi zaostrzeniami. Dane te nie pozwalają jednak przyjąć, że każde wyhodowanie Trichosporon z plwociny oznacza aktywne zakażenie wymagające leczenia.

Autorzy i ośrodki badawcze

Pracę przygotował zespół kierowany przez badaczy z Oklahoma State University. Autorami publikacji byli Noopur Dasgupta, Rebecca Wilson, Chelsea L. Murphy, Kaylea M. Feldman, William C. Starr, Elizabeth Pascual oraz Erika I. Lutter.

Noopur Dasgupta odpowiadała między innymi za opracowanie danych, analizę formalną, przeprowadzenie badań, metodykę oraz zarządzanie projektem. Erika I. Lutter opracowała koncepcję badania, sprawowała nadzór nad projektem, uczestniczyła w analizach i badaniach, pozyskała finansowanie oraz przygotowała pierwotną wersję manuskryptu. W analizach bioinformatycznych uczestniczyła między innymi Chelsea L. Murphy.

Większość autorów była związana z Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University w Stillwater w stanie Oklahoma. Chelsea L. Murphy reprezentowała High-Performance Computing Center, Oklahoma State University. Materiał kliniczny pochodził z Pulmonary and Cystic Fibrosis Clinic at Oklahoma Children’s Hospital w Oklahoma City.

Badanie zostało wsparte grantem National Institutes of Health o numerze 2R15GM124670, przyznanym Erice I. Lutter. Wyniki opublikowano w czasopiśmie Microbiology Resource Announcements, wydawanym przez American Society for Microbiology.

Pochodzenie izolatu Trichosporon asahii OK01

Izolat OK01 pochodził z próbki plwociny pobranej 6 marca 2014 roku od 38-letniego mężczyzny z mukowiscydozą. W momencie pobierania materiału pacjent nie przechodził zaostrzenia choroby płuc. Informacja ta ma istotne znaczenie interpretacyjne, ponieważ publikacja nie dostarcza podstaw do powiązania obecności badanego grzyba z ostrym pogorszeniem stanu klinicznego.

Próbki plwociny posiewano na podłożach selektywnych, w tym na agarze odżywczym, a następnie inkubowano przez 96 godzin w temperaturze 37°C. Uzyskany wzrost drobnoustrojów przechowywano jako kulturę mieszaną w 10-procentowym odtłuszczonym mleku w temperaturze −80°C.

W czasie przesiewowej oceny drobnoustrojów wielolekoopornych z kultury wyodrębniono izolat określony następnie jako Trichosporon asahii OK01. Autorzy podali, że izolat wykazywał oporność na cyprofloksacynę, oksacylinę i polimyksynę B w zastosowanym systemie przesiewowym.

Sekwencjonowanie i składanie genomu

Genomowe DNA izolatu uzyskano z wykorzystaniem zestawu ZR Fungal/Bacterial DNA Miniprep Kit. Stężenie i czystość materiału oceniono spektrofotometrycznie, a jakość zweryfikowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Materiał przekazano następnie do SeqCenter w Pittsburghu, gdzie przeprowadzono sekwencjonowanie całogenomowe w technologii Illumina.

Bibliotekę przygotowano z zastosowaniem procedury obejmującej tagmentację i amplifikację PCR. Sekwencjonowanie wykonano na platformie Illumina NovaSeq 6000, uzyskując odczyty typu paired-end o długości 2 × 151 par zasad. Po kontroli jakości przeprowadzonej z wykorzystaniem programu bcl-convert uzyskano łącznie 8 268 848 odczytów.

W części metodologicznej autorzy podali średnią głębokość sekwencjonowania wynoszącą 51,4×. W tabeli szczegółowych statystyk sekwencjonowania i złożenia zamieszczono natomiast wartość pokrycia 42,5×. Publikacja nie wyjaśnia tej różnicy. Wartości mogą odnosić się do odmiennych etapów przetwarzania danych lub różnych sposobów obliczania pokrycia, dlatego nie powinny być arbitralnie ujednolicane.

Odczyty złożono za pomocą programu Unicycler w wersji 0.4.8. Statystyki złożenia obliczono w programie QUAST w wersji 5.0.2. Kompletność genomu oceniono narzędziem BUSCO 5.8.2 przy użyciu zbioru referencyjnego Tremellomycetes odb12.

Najważniejsze wyniki analizy genomu

Końcowe złożenie genomu T. asahii OK01 obejmowało 113 kontigów o łącznej długości 24 304 609 par zasad, czyli około 24,31 miliona par zasad. Zawartość par guanina–cytozyna wynosiła 59,59 procent.

Wartość N50 wyniosła 414 355 par zasad, natomiast L50 – 18. Oznacza to, że połowa całkowitej długości złożenia znajdowała się w 18 największych kontigach, a graniczna długość kontigu w tej części zestawu wynosiła 414 355 par zasad.

Kompletność oceniona metodą BUSCO wyniosła 95,10 procent. Wynik wskazuje, że w złożeniu odnaleziono zdecydowaną większość oczekiwanych, konserwowanych genów używanych jako markery kompletności genomu. Nie oznacza to jednak, że uzyskano w pełni zamkniętą sekwencję wszystkich chromosomów. Genom pozostaje złożeniem roboczym, podzielonym na ponad sto kontigów.

Potwierdzenie identyfikacji gatunkowej

Wstępną identyfikację taksonomiczną przeprowadzono poprzez porównanie wszystkich kontigów z bazą sekwencji nukleotydowych National Center for Biotechnology Information. Analiza homologii BLAST wskazała, że badany izolat należy do gatunku Trichosporon asahii.

W celu dodatkowego potwierdzenia klasyfikacji autorzy przeanalizowali sekwencje obejmujące geny 18S rybosomalnego RNA, region ITS1, gen 5.8S rRNA, region ITS oraz gen 28S rRNA. Sekwencje referencyjne pobrano z NCBI, a następnie wyrównano za pomocą Clustal Omega. Drzewo filogenetyczne skonstruowano w programie FastTree, ukorzeniono sekwencjami Cryptococcus neoformans i zwizualizowano w narzędziu iTOL.

Przedstawione w publikacji drzewo filogenetyczne umiejscawia izolat OK01 w obrębie grupy sekwencji T. asahii, oddzielonej od innych analizowanych gatunków rodzaju Trichosporon. Wynik stanowi niezależne wsparcie dla identyfikacji uzyskanej w analizie podobieństwa całego złożenia.

Publiczne udostępnienie danych

Projekt Whole Genome Shotgun zdeponowano w bazach DDBJ/ENA/GenBank pod numerem dostępu JBVVWQ000000000. Wersja genomu opisana w publikacji ma numer JBVVWQ010000000. Surowe odczyty sekwencyjne udostępniono w Sequence Read Archive w ramach projektu PRJNA1431409. Numer BioSample to SAMN56309270.

Znaczenie i ograniczenia publikacji

Najważniejszym rezultatem pracy jest stworzenie publicznie dostępnego zasobu genomowego pochodzącego z izolatu uzyskanego od pacjenta z mukowiscydozą. Dane mogą być wykorzystywane w przyszłości do porównań filogenomicznych, poszukiwania różnic między szczepami środowiskowymi i klinicznymi, analiz genów związanych z adaptacją do dróg oddechowych oraz opracowywania dokładniejszych metod identyfikacji molekularnej.

Sama publikacja nie analizuje jednak genów wirulencji, mechanizmów oporności na leki przeciwgrzybicze, ekspresji genów ani interakcji grzyba z nabłonkiem oddechowym i układem odpornościowym. Nie przedstawiono również kolejnych wyników posiewów, danych spirometrycznych, obrazu klinicznego pacjenta, zastosowanego leczenia ani długoterminowych wyników obserwacji.

Nie można zatem ustalić, czy OK01 był przejściowo obecny w plwocinie, trwale kolonizował drogi oddechowe, czy powodował zakażenie. Szczególnie istotna jest informacja, że w chwili pobrania próbki pacjent nie miał zaostrzenia choroby płuc. Badanie nie pozwala także określić częstości występowania T. asahii w populacji osób z mukowiscydozą, ponieważ obejmuje jeden izolat pochodzący od jednego pacjenta.

Wnioski

Praca zespołu Oklahoma State University rozszerza katalog genomów klinicznych izolatów Trichosporon asahii i dostarcza materiału do dalszych badań nad grzybami wykrywanymi w drogach oddechowych osób z mukowiscydozą. Potwierdzono przynależność izolatu OK01 do T. asahii, uzyskano szkic genomu o wysokiej kompletności i udostępniono dane w międzynarodowych repozytoriach.

Znaczenia pracy nie należy jednak utożsamiać z wykazaniem chorobotwórczości izolatu. Publikacja opisuje genom pojedynczego szczepu, a nie badanie kliniczne dotyczące zakażenia, rokowania lub leczenia. Do określenia roli T. asahii w mukowiscydozie potrzebne są analizy większych grup pacjentów, powtarzane badania mikrobiologiczne, dane kliniczne oraz badania funkcjonalne i porównawcze genomów.

Źródło: Microbiology Resource Announcements, Draft genome sequence of Trichosporon asahii OK01 isolated from a cystic fibrosis patient in Oklahoma.
DOI: https://doi.org/10.1128/mra.00291-26