Zmodyfikowane tRNA może przywracać produkcję białek w chorobach wywołanych mutacjami nonsensownymi

Naukowcy z University of Toronto opracowali eksperymentalną strategię terapeutyczną wykorzystującą zmodyfikowany transferowy RNA (tRNA), której celem jest umożliwienie komórkom ominięcia przedwczesnych sygnałów zatrzymujących syntezę białka. Podejście przetestowano przede wszystkim w laboratoryjnych i przedklinicznych modelach mukowiscydozy. Badacze wykazali możliwość przywrócenia produkcji pełnej długości białka CFTR i jego funkcji, a także połączenia terapii tRNA z istniejącymi modulatorami CFTR. Autorzy widzą w tej technologii potencjalną podstawę bardziej uniwersalnej strategii leczenia chorób spowodowanych mutacjami nonsensownymi.

Zmodyfikowany tRNA jako potencjalna platforma terapeutyczna

Zespół z University of Toronto opracował podejście należące do rozwijającego się obszaru medycyny opartej na transferowym RNA, czyli tRNA. Zamiast przygotowywać osobną strategię terapeutyczną dla każdej pojedynczej mutacji genetycznej, badacze chcą wykorzystać fakt, że podobny mechanizm prowadzący do choroby może występować w wielu różnych genach.

Badaniami kierował Bowen Li, associate professor w Leslie Dan Faculty of Pharmacy na University of Toronto oraz affiliate scientist w Princess Margaret Cancer Centre należącym do University Health Network. Jak wskazują autorzy projektu, jednym z podstawowych problemów medycyny genetycznej jest ogromna różnorodność mutacji chorobotwórczych. Wiele z nich występuje jedynie u niewielkich grup pacjentów, co utrudnia opracowanie odrębnej terapii dla każdego konkretnego wariantu.

Strategia oparta na tRNA ma działać na innym poziomie. Jeżeli różne mutacje występujące w różnych genach prowadzą do tego samego rodzaju błędu w procesie wytwarzania białka, potencjalnie możliwe byłoby zastosowanie wspólnego mechanizmu terapeutycznego wobec większej grupy chorób.

Według zespołu długoterminowym celem jest stworzenie leków opartych na tRNA, które będą rozpoznawały wspólne przedwczesne sygnały zakończenia syntezy białka. Taka strategia mogłaby znaleźć zastosowanie w wielu różnych chorobach genetycznych, w tym w rzadkich schorzeniach, dla których obecnie istnieje niewiele skutecznych możliwości terapeutycznych lub nie ma ich wcale.

Mutacje nonsensowne przedwcześnie zatrzymują produkcję białka

Zespół skoncentrował się na tak zwanych mutacjach nonsensownych. Prowadzą one do pojawienia się przedwczesnego sygnału zakończenia w informacji genetycznej wykorzystywanej podczas syntezy białka. W rezultacie komórka może wytwarzać niewielką ilość pełnej długości funkcjonalnego białka albo nie wytwarzać go wcale.

Konsekwencje zależą od genu, którego dotyczy mutacja, oraz od funkcji kodowanego przez niego białka. Ten sam typ błędu może więc leżeć u podstaw chorób dotyczących różnych narządów i tkanek.

Zgodnie z informacjami przedstawionymi przez autorów materiału mutacje nonsensowne odpowiadają za około 11% dziedzicznych chorób genetycznych. Mimo że stanowią jedynie część wszystkich mutacji chorobotwórczych, związane są z tysiącami schorzeń, w tym z niektórymi postaciami mukowiscydozy oraz określonymi chorobami mięśniowymi i neurologicznymi.

Badacze zmodyfikowali tRNA w taki sposób, aby pomóc komórce przejść przez przedwcześnie pojawiający się sygnał zatrzymania i kontynuować produkcję białka. Celem nie było więc jedynie zwiększenie ilości fragmentu białka, lecz doprowadzenie do powstania jego pełnej długości i – co szczególnie istotne – odzyskania funkcji.

Naturalne modyfikacje tRNA wskazały kierunek dalszych prac

Jednym z kluczowych problemów było uzyskanie odpowiedniej aktywności i trwałości skonstruowanego tRNA. W pracach uczestniczyła Haissi Cui, assistant professor of chemistry w Faculty of Arts & Science na University of Toronto.

Zespół zwrócił uwagę na chemiczne modyfikacje występujące naturalnie w cząsteczkach tRNA. Badacze wykorzystali naturę jako punkt odniesienia przy projektowaniu zmodyfikowanych cząsteczek i oceniali, czy odtworzenie określonych chemicznych cech naturalnego tRNA może poprawić właściwości przygotowywanej terapii.

Według materiału jedna z zastosowanych modyfikacji okazała się szczególnie istotna: zwiększyła aktywność zaprojektowanego tRNA i wydłużyła jego działanie. Wynik ten wskazał, że połączenie chemii z biologią RNA może być ważnym elementem projektowania przyszłych leków wykorzystujących tRNA.

Samo skonstruowanie aktywnej cząsteczki nie rozwiązywało jednak drugiego zasadniczego problemu. Aby tRNA mogło działać jako lek, musiało zostać skutecznie dostarczone do właściwych komórek.

Nanocząstki lipidowe zaprojektowane specjalnie dla tRNA

Za jeden z najważniejszych etapów projektu badacze uznają opracowanie odpowiedniego systemu dostarczania tRNA. W pracach uczestniczył Jingan (Charles) Chen, researcher w laboratorium Bowena Li oraz PhD candidate w Leslie Dan Faculty of Pharmacy i Institute of Biomedical Engineering.

Zespół zdecydował się wykorzystać nanocząstki lipidowe. Autorzy odwołują się przy tym do technologii lipidowych cząstek wykorzystywanych do transportowania mRNA w szczepionkach przeciw COVID-19, zaznaczając jednak, że system dostarczania wymagał przeprojektowania odpowiednio do zupełnie innego ładunku, jakim jest tRNA.

Mukowiscydoza jako model choroby wywołanej mutacjami nonsensownymi

Głównym modelem wykorzystanym do oceny nowej technologii była mukowiscydoza. W ostatnich latach leczenie tej choroby zostało istotnie zmienione przez modulatory CFTR, takie jak Trikafta. Leki te działają jednak na istniejące białko CFTR. Jeżeli wskutek mutacji nonsensownej pełnej długości białko nie zostaje wytworzone, możliwości działania modulatora są ograniczone.

Zgodnie z materiałem przedstawionym przez University of Toronto modulatory CFTR nie są skuteczne u około jednego na dziesięciu pacjentów, u których choroba związana jest z mutacją nonsensowną. Dlatego naukowcy postawili pytanie, czy zmodyfikowany tRNA może doprowadzić do ponownego wytworzenia białka CFTR, które następnie będzie zdolne do wykonywania swojej funkcji.

Powrót białka CFTR i jego funkcji

W ludzkich komórkach dróg oddechowych zawierających dwie często występujące mutacje nonsensowne badacze zaobserwowali ponowne pojawienie się białka CFTR. Kluczowe znaczenie miało jednak nie samo wykrycie białka, lecz sprawdzenie, czy odzyskało ono funkcję. Według autorów tak właśnie się stało.

Materiał wskazuje również, że efekt utrzymywał się przez ponad 40 dni. Dalsze badania przedkliniczne dawały wyniki zgodne z obserwacjami dokonanymi w komórkach dróg oddechowych.

Organoidy pochodzące od pacjenta z czterema wariantami CFTR

W badaniach uczestniczyli także Jim Hu i Tanja Gonska, scientists w SickKids posiadający appointments w Temerty Faculty of Medicine na University of Toronto. Zespół uzyskał dzięki nim dostęp do tkanki pacjenta z mukowiscydozą o złożonym genotypie CFTR obejmującym cztery mutacje, z których dwie były mutacjami nonsensownymi. Według materiału pacjent nie odpowiadał na dostępne leczenie.

Komórki wykorzystano do stworzenia miniaturowych modeli tkankowych – organoidów. Pozwoliły one ocenić działanie zmodyfikowanego tRNA oraz modulacji CFTR w materiale pochodzącym bezpośrednio od chorego.

W tym modelu ani zmodyfikowany tRNA, ani Trikafta stosowane osobno nie powodowały dużej odpowiedzi. Inny wynik uzyskano po połączeniu obu interwencji. tRNA przywracał produkcję pełnej długości białka, dzięki czemu modulator CFTR otrzymywał białko, na które mógł następnie oddziaływać.

Od mukowiscydozy do potencjalnej platformy dla wielu chorób

Autorzy podkreślają, że znaczenie projektu może wykraczać poza mukowiscydozę. Mutacje prowadzące do podobnego przedwczesnego zatrzymania syntezy białka występują w różnych genach i mogą powodować choroby płuc, mózgu, mięśni oraz innych tkanek.

Zamiast opracowywania terapii od początku dla każdej pojedynczej mutacji, długoterminowym celem zespołu jest stworzenie leków tRNA rozpoznających wspólne typy przedwczesnych sygnałów zatrzymania. Jedna strategia mogłaby wówczas potencjalnie znaleźć zastosowanie w różnych chorobach genetycznych posiadających odpowiedni mechanizm molekularny.

Badacze zaznaczają jednak, że rozszerzenie technologii na kolejne narządy będzie wymagało dalszych prac nad sposobem dostarczania. Poszczególne tkanki mogą potrzebować odmiennie przygotowanych systemów transportujących tRNA.

Możliwa droga do terapii wziewnej

W przypadku płuc zespół uzyskał dodatkowy wynik istotny z punktu widzenia przyszłego sposobu podawania: opracowane nanocząstki przetrwały proces przekształcania preparatu w drobną mgłę. Autorzy traktują to jako pierwszy krok w kierunku potencjalnego leku, który w przyszłości mógłby być podawany drogą wziewną.

Nie oznacza to jednak, że opracowano już gotową terapię inhalacyjną dla pacjentów. Badanie przedstawione w materiale obejmuje etap laboratoryjny i przedkliniczny, a sami naukowcy opisują uzyskane wyniki jako podstawę do dalszego rozwoju technologii.

Finansowanie badania

Badania były wspierane przez Canadian Institutes of Health Research, Natural Sciences and Engineering Research Council, Cystic Fibrosis Canada, Cystic Fibrosis Foundation, New Frontiers in Research Fund, Canada Research Chairs Program, Connaught Fund, Harrington Discovery Institute oraz National Institutes of Health.