Ponowna analiza WES może wyjaśnić nierozpoznane genetycznie przypadki pierwotnej dyskinezy rzęsek

Ponowna analiza danych z sekwencjonowania całego eksomu może dostarczyć nowych odpowiedzi u dzieci z klinicznym podejrzeniem pierwotnej dyskinezy rzęsek, u których wcześniejsze badanie genetyczne nie pozwoliło ustalić przyczyny choroby. Naukowcy z Gazi University w Ankarze ponownie przeanalizowali dane WES 34 pacjentów pediatrycznych. U trzech z nich udało się ustalić rozpoznanie molekularne, a w kolejnych przypadkach wskazano rzadkie warianty w genach mogących mieć znaczenie dla funkcji rzęsek, lateralizacji lub podatności na zakażenia dróg oddechowych. Wyniki opublikowano w czasopiśmie Pediatric Pulmonology.

Ponowna analiza danych genetycznych dzieci z podejrzeniem PCD

Pierwotna dyskineza rzęsek (primary ciliary dyskinesia, PCD) jest genetycznie heterogenną chorobą wynikającą z zaburzeń budowy lub funkcji ruchomych rzęsek. Konsekwencją jest przede wszystkim upośledzenie oczyszczania śluzowo-rzęskowego, które sprzyja przewlekłemu mokremu kaszlowi, nawracającym zakażeniom układu oddechowego, zapaleniom zatok, przewlekłym problemom otologicznym oraz rozwojowi rozstrzeni oskrzeli. Zaburzenie funkcji rzęsek w okresie rozwoju zarodkowego może również prowadzić do nieprawidłowości lateralizacji narządów, takich jak situs inversus czy heterotaksja.

Autorzy publikacji podkreślają, że mimo szybkiego rozwoju diagnostyki molekularnej u części osób z silnym klinicznym podejrzeniem PCD nadal nie udaje się ustalić przyczyny genetycznej. Według danych przywoływanych przez badaczy molekularnego rozpoznania nie można uzyskać u około 20–30% klinicznie podejrzanych przypadków nawet po zastosowaniu kompleksowej diagnostyki genetycznej.

Badanie przeprowadzili Tilbe Hakçıl Öz, Tuğba Şişmanlar Eyüboğlu, Ayşe Tana Aslan, Nilgün Kula i Gülsüm Kayhan. Autorzy reprezentowali Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Gazi University oraz Department of Pediatric Pulmonology, Faculty of Medicine, Gazi University w Ankarze. Praca została opublikowana w 2026 roku w czasopiśmie Pediatric Pulmonology.

Jak przeprowadzono reanalizę WES

Do badania retrospektywnie włączono 34 niespokrewnionych pacjentów pediatrycznych ocenianych w ośrodku trzeciego stopnia referencyjności w latach 2019–2023. U każdego z nich PCD stanowiła główne rozważane rozpoznanie kliniczne, a wcześniejsza rutynowa analiza WES nie wykazała wariantów pozwalających ustalić molekularną przyczynę choroby.

Materiałem do badań było DNA wyizolowane z krwi obwodowej. WES wykonywano z wykorzystaniem platform NovaSeq 6000 lub MGISEQ-2000. Co najmniej 97% regionów docelowych we wszystkich próbkach osiągało pokrycie co najmniej 20×.

Istotnym elementem badania była zmiana sposobu analizy danych. Część wcześniejszych analiz wykonywano w oprogramowaniu VarAFT, umożliwiającym przede wszystkim wykrywanie wariantów pojedynczych nukleotydów. Późniejsze analizy korzystały z rozwiązania Ilyome pozwalającego również na ocenę wariantów liczby kopii. W ramach obecnego badania wszystkie przypadki ponownie przeanalizowano za pomocą ujednoliconego pipeline’u Ilyome opartego na genomie referencyjnym GRCh38.

Uwzględniono zarówno warianty pojedynczych nukleotydów i małe insercje/delecje, jak i warianty liczby kopii (copy number variants, CNV). Adnotacje wariantów aktualizowano na podstawie m.in. gnomAD v4.1.0, ClinVar i OMIM oraz specjalistycznych zasobów dotyczących rzęsek.

Schemat przedstawiony przez autorów na rycinie 1 publikacji pokazuje trzyetapową strategię diagnostyczną. Najpierw analizowano dobrze poznane geny PCD oraz geny związane z fenotypami nakładającymi się na PCD. Następnie poszukiwano potencjalnych nowych genów chorobowych. W trzecim etapie oceniano możliwość dziedziczenia digenicznego, czyli sytuacji, w której warianty w dwóch różnych genach mogłyby wspólnie wpływać na fenotyp.

Poszukiwanie nowych genów-kandydatów

Autorzy nie ograniczyli analizy wyłącznie do znanych genów PCD. Do priorytetyzacji potencjalnych nowych genów wykorzystywali m.in. CilioGenics, Syscilia Gold Standard, CiliaCarta oraz kategorie Gene Ontology odnoszące się do budowy i funkcji rzęsek. Brano pod uwagę częstość wariantów, przewidywany wpływ na białko, ekspresję genu w tkankach zawierających ruchome rzęski, zgodność genotypu z fenotypem oraz – jeśli materiał rodzinny był dostępny – segregację wariantu.

Dla wybranych wariantów oceniano również CADD oraz zintegrowane predykcje in silico. Ekspresję genów analizowano przy wykorzystaniu GTEx i Human Protein Atlas. Geny bez dowodów ekspresji w nabłonku oddechowym lub innych tkankach zawierających ruchome rzęski miały niższy priorytet.

Charakterystyka kliniczna 34 dzieci

W badaniu uczestniczyło 16 dziewcząt i 18 chłopców, a średni wiek wynosił 9,4 ± 4,96 roku. Pokrewieństwo rodziców potwierdzono w 13 rodzinach, czyli w 38,2% kohorty. W kolejnych sześciu rodzinach oboje rodzice pochodzili z tej samej miejscowości, co mogło wskazywać na dalsze wspólne pochodzenie.

Objawy kliniczne były typowe dla grupy kierowanej do diagnostyki PCD. Zaburzenia oddychania w okresie noworodkowym stwierdzono u 22 z 34 dzieci, czyli u 64,7%. Do oddziału intensywnej terapii noworodka przyjęto 23 pacjentów. Nieprawidłowości położenia narządów występowały u 11 dzieci, a strukturalne wrodzone wady serca u 12.

Nawracające zakażenia dolnych dróg oddechowych występowały u 79,4% badanych, przewlekły nieżyt nosa u 50%, nawracające zapalenie zatok u 38,2%, a przewlekłe problemy otologiczne u 35,3%. Radiologicznie potwierdzone rozstrzenia oskrzeli występowały u czterech pacjentów.

Test chlorkowy potu przeprowadzono u 27 dzieci i we wszystkich przypadkach wynik był prawidłowy. U pozostałych siedmiu pacjentów obraz kliniczny nie sugerował mukowiscydozy. Analizę ruchu rzęsek metodą high-speed video microscopy analysis (HSVMA) wykonano u 20 pacjentów. U pięciu z nich obserwowano prawidłowy wzorzec ruchu rzęsek.

Dostępność innych specjalistycznych badań była ograniczona. Pomiar stężenia tlenku azotu w nosie wykonano tylko u jednego pacjenta i uzyskano wynik poniżej progu diagnostycznego, natomiast transmisyjną mikroskopię elektronową przeprowadzono u jednego chorego, uzyskując prawidłowy obraz ultrastruktury.

Ponowna analiza przyniosła trzy rozpoznania molekularne

Najważniejszym wynikiem badania było ustalenie molekularnej przyczyny choroby u 3 z 34 pacjentów, czyli 8,8% dzieci, u których wcześniejsza analiza WES była niediagnostyczna. Warianty dotyczyły trzech znanych genów PCD: CCDC40, CCDC114 i CFAP300.

W dwóch z trzech rozpoznanych przypadków kluczowe okazało się wykrycie dużych zmian liczby kopii, których pierwotny sposób analizy nie identyfikował. Dotyczyło to delecji w CCDC40 oraz CCDC114.

Trzeci pacjent miał homozygotyczny wariant w genie CFAP300. Jego znaczenie kliniczne wspierały opublikowane w międzyczasie dane oraz stwierdzenie tego samego wariantu w stanie homozygotycznym u chorego rodzeństwa.

Warianty o niepewnym znaczeniu w znanych genach chorobowych

U siedmiu pacjentów stwierdzono rzadkie warianty o niepewnym znaczeniu klinicznym (VUS) w genach mających już opisane fenotypy w OMIM. Były to GAS2L2, DNAH8, MMP21, RPGR, DNAH5, DNAH11 i MPDZ. Mimo ponownej interpretacji z wykorzystaniem aktualnego fenotypu i dostępnych danych segregacyjnych ich klasyfikacja według kryteriów ACMG/AMP nie uległa zmianie.

Jest to istotne z klinicznego punktu widzenia: samo znalezienie rzadkiego wariantu w genie związanym z rzęskami nie wystarcza do ustalenia rozpoznania PCD. Konieczna jest odpowiednia siła dowodów dotyczących patogenności, sposobu dziedziczenia oraz zgodności z fenotypem.

Geny-kandydaci mogą poszerzyć wiedzę o biologii PCD

Drugim ważnym elementem pracy było poszukiwanie potencjalnych nowych genów związanych z PCD lub fenotypami przypominającymi tę chorobę. Autorzy wskazali kilka grup biologicznie prawdopodobnych kandydatów, ale wyraźnie podkreślili, że wymagają one potwierdzenia w niezależnych kohortach i badań funkcjonalnych.

RIBC1, NINL, DNAH14 i SPMIP2 jako potencjalne geny PCD

Najbardziej bezpośredni związek z budową lub funkcją rzęsek autorzy rozważali w przypadku genów RIBC1, NINL, DNAH14 i SPMIP2.

RIBC1 koduje białko wewnętrzne mikrotubuli, występujące m.in. w nabłonku oddechowym i lokalizujące się w obrębie mikrotubul aksonemy. Rzadkie warianty hemizygotyczne wykryto u dwóch pacjentów. Jeden z nich miał zaburzenia oddychania w okresie noworodkowym, nawracające zakażenia górnych dróg oddechowych, przewlekły nieżyt nosa i hipokinetyczne rzęski w HSVMA. Dane eksperymentalne przywołane przez autorów wskazują, że niedobór RIBC1 może zaburzać strukturę i ruchliwość wici.

U pacjenta z zaburzeniami oddychania w okresie noworodkowym, dekstrokardią, nawracającymi zakażeniami i zapaleniami zatok wykryto homozygotyczny wariant miejsca akceptorowego splicingu w NINL. Białko NINL uczestniczy w procesach związanych z transportem pęcherzykowym w rejonie podstawy rzęski. Autorzy przywołują również badania na danio pręgowanym, w których zaburzenie funkcji tego genu powodowało fenotypy typowe dla ciliopatii.

U dziecka z nawracającymi zapaleniami zatok, zakażeniami układu oddechowego i rozstrzeniami oskrzeli stwierdzono homozygotyczny wariant missense w genie DNAH14. Gen koduje ciężki łańcuch dyneiny i wykazuje ekspresję w tkankach zawierających ruchome rzęski. Autorzy traktują jednak jego związek z PCD jako hipotezę wymagającą dalszych badań.

U pacjenta P8, którego fenotyp obejmował zaburzenia oddychania w okresie noworodkowym, nawracające zakażenia dróg oddechowych, rozstrzenia oskrzeli, hipokinetyczne rzęski oraz bardzo niskie stężenie tlenku azotu w nosie, wykryto homozygotyczny wariant skracający w SPMIP2. Gen koduje białko związane z wewnętrzną strukturą mikrotubul, jednak jego ekspresja w drogach oddechowych jest niewielka. Z tego względu jego ewentualny udział w PCD pozostaje do potwierdzenia.

CRYBG1, USHBP1 i TRIM34 mogą wpływać na podatność na zakażenia

Nie wszystkie wskazane geny-kandydaci muszą odpowiadać bezpośrednio za dysfunkcję ruchomych rzęsek. Autorzy zwracają uwagę na trzy geny – CRYBG1, USHBP1 i TRIM34 – których potencjalny wpływ może dotyczyć raczej odpowiedzi immunologicznej, integralności nabłonka i mechanizmów obrony przeciwwirusowej.

Takie zaburzenia mogłyby powodować nawracające zakażenia układu oddechowego i fenotyp częściowo przypominający PCD bez klasycznej pierwotnej nieprawidłowości struktury rzęsek.

Przykładem był pacjent P4 z nawracającymi zakażeniami, przewlekłym nieżytem nosa i rozstrzeniami oskrzeli, u którego wykryto homozygotyczny wariant typu frameshift w TRIM34. Jednocześnie pacjent miał homozygotyczny wariant missense w GAS2L2, genie związanym z orientacją rzęsek. Autorzy wskazują, że nieprawidłowy wynik HSVMA u tego chorego może być bardziej zgodny z potencjalnym udziałem GAS2L2 w fenotypie rzęskowym, podczas gdy TRIM34 mógłby wpływać na podatność na infekcje.

WDR90 jako kandydat związany z lateralizacją

Szczególnie interesujące wyniki uzyskano u pacjenta P21 z ciężkim i złożonym fenotypem obejmującym zaburzenia oddychania w okresie noworodkowym, dekstrokardię, wady sercowo-naczyniowe, wodogłowie oraz przewlekłe zapalenie ucha środkowego. U dziecka potwierdzono dwa różne warianty WDR90 znajdujące się na przeciwnych allelach, czyli w układzie trans.

WDR90 koduje białko centriolarne uczestniczące w stabilizacji tripletów mikrotubul i ciliogenezie. Gen wykazuje zwiększoną ekspresję w układzie oddechowym. Nie został jednak dotychczas jednoznacznie powiązany z zaburzeniami lateralizacji u człowieka.

Autorzy uważają, że biologicznie prawdopodobny jest jego udział w kształtowaniu osi lewo-prawo, ale nie traktują tego przypadku jako dowodu ustanawiającego WDR90 nowym genem PCD. U tego samego pacjenta stwierdzono również homozygotyczny wariant w MPDZ, który może wyjaśniać część innych elementów fenotypu, w tym wodogłowie.

Czy dwa różne geny mogą wspólnie powodować PCD?

Autorzy analizowali również hipotezę dziedziczenia digenicznego. U dwóch pacjentów wykryto rzadkie warianty heterozygotyczne w więcej niż jednym genie związanym z PCD.

U pacjenta P16 występowały warianty w DNAI1 oraz DNAH6, a u pacjenta P10 – w RPGR oraz NME8. Analiza segregacji rodzinnej nie dostarczyła jednak przekonujących dowodów na przyczynowy mechanizm digeniczny. Warianty były dziedziczone od matek, a rozkład cech klinicznych w rodzinach nie odpowiadał jednoznacznie przewidywanemu mechanizmowi.

Autorzy dopuszczają możliwość działania modyfikującego lub oligogenicznego, ale podkreślają konieczność przeprowadzenia badań funkcjonalnych.

Co wyniki oznaczają dla diagnostyki pierwotnej dyskinezy rzęsek?

Badanie wskazuje, że u części pacjentów zakończenie pierwszej analizy WES wynikiem niediagnostycznym nie musi oznaczać wyczerpania możliwości tego badania. Dane eksomowe można po pewnym czasie poddać ponownej analizie, zwłaszcza jeżeli pierwotny pipeline nie obejmował pełnego wykrywania CNV lub analiza była przeprowadzona w okresie, gdy wiedza dotycząca niektórych wariantów i genów była bardziej ograniczona.

W praktyce szczególnie istotne okazało się włączenie do pipeline’u wykrywania wariantów liczby kopii. Dwa spośród trzech nowych rozpoznań wynikały z dużych delecji, których wcześniejsza analiza nie zidentyfikowała.

Autorzy zwracają również uwagę na rolę regularnej aktualizacji baz danych, piśmiennictwa oraz relacji gen–choroba. W przypadku CFAP300 znaczenie wcześniej wykrytej zmiany można było ocenić dokładniej dzięki nowszym publikacjom i danym segregacyjnym pochodzącym z rodziny.

Znaczenie dla rodzin i poradnictwa genetycznego

Ustalenie molekularnego rozpoznania ma znaczenie nie tylko dla potwierdzenia przyczyny objawów, lecz także dla poradnictwa genetycznego. W chorobie tak heterogennej jak PCD prawidłowe określenie genu i wariantu pozwala lepiej ocenić sposób dziedziczenia i ryzyko wystąpienia choroby u kolejnych dzieci w rodzinie.

Może mieć to szczególne znaczenie w populacjach o dużej częstości związków krewniaczych. W analizowanej kohorcie pokrewieństwo rodziców potwierdzono w ponad jednej trzeciej rodzin.

Wnioski

Badanie zespołu z Gazi University pokazuje, że systematyczna reanaliza danych WES może dostarczyć klinicznie istotnych informacji u dzieci z podejrzeniem pierwotnej dyskinezy rzęsek, u których pierwsza analiza genetyczna nie przyniosła rozpoznania. W grupie 34 pacjentów dodatkowe rozpoznanie molekularne uzyskano u trzech osób, czyli u 8,8% badanych.

Szczególnie ważnym elementem okazało się wykrywanie CNV: dwie z trzech nowych diagnoz wynikały z delecji, które zostały pominięte przez wcześniejsze pipeline’y bioinformatyczne. Trzeci przypadek pokazuje natomiast, że nowe dane literaturowe oraz informacje o segregacji rodzinnej mogą zmienić znaczenie wcześniej niejednoznacznych obserwacji.

Jednocześnie zidentyfikowane warianty w RIBC1, NINL, DNAH14, SPMIP2, CRYBG1, USHBP1, TRIM34 i WDR90 należy traktować przede wszystkim jako kierunek dalszych badań. Publikacja nie dowodzi jeszcze, że wszystkie te geny są nowymi przyczynami PCD. Autorzy wskazują potrzebę ich identyfikacji u kolejnych niezależnych pacjentów oraz eksperymentalnej walidacji wpływu wariantów na rzęski, nabłonek oddechowy, odporność i procesy lateralizacji.

Źródło: Pediatric Pulmonology, Systematic Reanalysis of Whole-Exome Sequencing in Genetically Unsolved Pediatric Primary Ciliary Dyskinesia.
DOI: https://doi.org/10.1002/ppul.71776