Pseudomonas aeruginosa, ETI i bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe – czego dowodzi nowe badanie?

W osoczu osób z mukowiscydozą można wykryć zwiększoną aktywność związaną z bakteryjnymi pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, a najsilniejszy sygnał obserwowano u pacjentów z potwierdzonym zakażeniem lub kolonizacją Pseudomonas aeruginosa. W pilotażowym badaniu zespołu z Erlangen interesujące wyniki uzyskano również u osób leczonych elexacaftorem, tezacaftorem i ivacaftorem (ETI). Autorzy podkreślają jednak, że zastosowana metoda mierzy przede wszystkim aktywność lipopolisacharydu zależną od TLR4 i NF-κB, a nie bezpośrednio liczbę pęcherzyków bakteryjnych. Nie udało się również wykazać, że materiał obecny w krążeniu pochodził konkretnie od P. aeruginosa.

Bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe jako potencjalny element patogenezy mukowiscydozy

Mukowiscydoza jest chorobą uwarunkowaną mutacjami genu CFTR, prowadzącymi między innymi do nieprawidłowego transportu jonów przez nabłonek, zmiany właściwości śluzu oraz upośledzenia oczyszczania śluzowo-rzęskowego. W drogach oddechowych powstaje środowisko sprzyjające przewlekłej kolonizacji bakteryjnej i podtrzymywaniu procesu zapalnego.

Szczególne znaczenie kliniczne ma Pseudomonas aeruginosa – Gram-ujemna bakteria zdolna do przewlekłego utrzymywania się w drogach oddechowych osób z mukowiscydozą, tworzenia biofilmu oraz rozwijania mechanizmów oporności na antybiotyki. Jednym ze sposobów oddziaływania bakterii na otoczenie jest uwalnianie niewielkich struktur otoczonych błoną, określanych jako bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe – bacterial extracellular vesicles, bEVs.

Pęcherzyki mogą transportować cząsteczki biologicznie czynne na odległość od samej bakterii. W przypadku bakterii Gram-ujemnych jednym z najważniejszych ich składników jest lipopolisacharyd (LPS), aktywujący receptor Toll-like 4 (TLR4) i prowadzący do uruchomienia szlaków prozapalnych, w tym NF-κB.

Problem jest interesujący również z punktu widzenia diagnostyki. Leczenie wysoce skutecznymi modulatorami CFTR, zwłaszcza terapią potrójną elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor, poprawia czynność płuc, transport śluzowo-rzęskowy i jakość życia oraz zmniejsza ilość wydzieliny. Paradoksalnie mniejsza dostępność plwociny może jednak utrudniać mikrobiologiczną ocenę utrzymujących się zakażeń dróg oddechowych. Poszukuje się więc dodatkowych markerów, które w przyszłości mogłyby uzupełniać klasyczne metody diagnostyczne.

Zespół badawczy z Erlangen i projekt badania

Pracę zatytułowaną Detection of bacterial extracellular vesicles in patients with cystic fibrosis – a pilot study opublikowano w Journal of Cystic Fibrosis. Wśród autorów znaleźli się między innymi Celina von Mauch, Lisa-Maria Edrich, Julia Sobel, Annika Geppert, Jochen Mattner, Philipp Arnold, André Hoerning, Claudia Guenther, Alexander Schnell i Iris Stolzer.

Badacze byli związani z kilkoma jednostkami Universitätsklinikum Erlangen i Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, w tym Department of Pediatrics, Gastroenterology, Hepatology and Endoscopy, Department of Medicine 1, Department of Pediatrics, Pulmonology and Allergy oraz Institute of Clinical Microbiology, Immunology and Hygiene. W projekcie uczestniczyły również Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Profile Center Immunomedicine, Institute of Functional and Clinical Anatomy oraz Deutsches Zentrum Immuntherapie.

Materiał od osób z mukowiscydozą pobierano pomiędzy grudniem 2020 roku a styczniem 2023 roku w ramach rutynowych pobrań krwi. Grupę kontrolną stanowili zdrowi ochotnicy.

Status zakażenia P. aeruginosa określano na podstawie rutynowych badań mikrobiologicznych plwociny lub głębokich wymazów z gardła, wykonywanych u pacjentów z mukowiscydozą zwykle cztery do sześciu razy w roku. Pojedynczy dodatni wynik wystarczał do zakwalifikowania pacjenta do grupy PsA+. Przewlekłą kolonizację definiowano jako co najmniej trzy wyniki dodatnie spośród co najmniej sześciu badań wykonanych w ciągu roku.

W grupie PsA- znajdowało się 31 osób, a w grupie PsA+ 29. Wśród PsA- 22 osoby nigdy wcześniej nie miały wykrytej P. aeruginosa, natomiast u dziewięciu ostatnie wykrycie miało miejsce ponad 11 miesięcy wcześniej. W grupie PsA+ połowa pacjentów miała ostatni dodatni wynik w okresie krótszym niż sześć miesięcy, a połowa co najmniej sześć miesięcy wcześniej.

Jak badano pęcherzyki obecne w osoczu

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe izolowano z osocza, a następnie analizowano kilkoma wzajemnie uzupełniającymi się metodami. Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) wykorzystano do określania wielkości oraz liczby cząstek na podstawie analizy ich ruchów Browna. Morfologię wybranych preparatów oceniano przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Sama obecność pęcherzyków nie pozwala jednak określić ich pochodzenia. W osoczu znajdują się również liczne pęcherzyki uwalniane przez komórki człowieka. Dlatego kluczową część eksperymentu stanowił test HEK-Blue LPS wykorzystujący komórki z receptorem TLR4.

Po aktywacji TLR4 dochodzi w tym modelu do aktywacji NF-κB oraz wydzielania raporterowej alkalicznej fosfatazy. Autorzy oceniali zarówno względną indukcję NF-κB, jak i wyliczone stężenie aktywności LPS znormalizowane do liczby cząstek.

Badacze podjęli również próbę określenia pochodzenia materiału za pomocą Western blot. Wykorzystali przeciwciało przeciwko OprF jako markerowi P. aeruginosa oraz przeciwciało przeciwko OmpA jako bardziej ogólnemu markerowi błon zewnętrznych bakterii Gram-ujemnych.

Większa aktywność związana z materiałem bakteryjnym u osób z mukowiscydozą

Analiza NTA wykazała, że pęcherzyki izolowane z osocza osób z mukowiscydozą były przeciętnie większe niż struktury uzyskiwane od zdrowych osób. Najbardziej widoczna różnica wielkości wystąpiła w grupie PsA-. Obserwację różnic morfologicznych wspierały obrazy uzyskane w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Najważniejsze dane pochodziły jednak z funkcjonalnego testu TLR4. Względna indukcja NF-κB była istotnie większa u osób z mukowiscydozą niż u zdrowych uczestników. Istotną różnicę w stosunku do grupy kontrolnej stwierdzono również w grupie pacjentów PsA+.

Podobny obraz uzyskano po przeliczeniu aktywności LPS na liczbę cząstek. Osoby z mukowiscydozą wykazywały większą ilość aktywności LPS przypadającą na 10¹⁰ cząstek niż zdrowa grupa kontrolna.

Autorzy przeanalizowali także zależność od historii zakażenia P. aeruginosa. Aktywność związana z bEVs była nieco wyższa u pacjentów, u których wcześniej wykrywano tę bakterię, a najwyższe wartości pojawiały się u części osób z niedawnym zakażeniem. Różnice w tej szczegółowej analizie nie osiągnęły jednak poziomu istotności statystycznej.

Western blot nie potwierdził pochodzenia pęcherzyków od Pseudomonas aeruginosa

Przeciwciała OprF i OmpA dawały wyraźne sygnały w lizatach bakteryjnych oraz w referencyjnych pęcherzykach przygotowanych z hodowli P. aeruginosa. Oznacza to, że same przeciwciała oraz procedura detekcji działały w materiale kontrolnym.

W próbkach pęcherzyków wyizolowanych z osocza pacjentów nie uzyskano jednak wyraźnych prążków. Autorzy uznają, że prawdopodobną przyczyną mogła być bardzo mała ilość białka bakteryjnego w materiale klinicznym.

Na podstawie tych wyników można więc mówić o obecności komponentów charakterystycznych dla bakterii Gram-ujemnych i o zwiększonej aktywności związanej z LPS, ale nie można przypisać krążącego materiału na poziomie gatunku do P. aeruginosa.

Nieoczekiwany związek z terapią ETI

Jednym z najbardziej interesujących wyników była analiza pacjentów otrzymujących elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor. Do porównania włączono 33 osoby leczone ETI oraz 27 osób z mukowiscydozą, które nie otrzymywały tej terapii.

W grupie leczonej ETI stwierdzono istotnie większą aktywność związaną z bEVs niż u pacjentów nieprzyjmujących ETI. Różnicę obserwowano zarówno w analizie względnej indukcji NF-κB, jak i po przeliczeniu aktywności LPS względem liczby cząstek. W analizach podgrup efekt wydawał się w znacznym stopniu związany z pacjentami PsA+.

Autorzy rozważają kilka możliwych wyjaśnień. Terapia ETI znacząco zmienia fizjologię nabłonka, środowisko dróg oddechowych oraz skład mikrobiomu oddechowego i jelitowego. Te zmiany mogłyby pośrednio wpływać na ilość produktów bakteryjnych docierających do krążenia. Nie wiadomo jednak, czy obserwowane zjawisko wynika ze zmian bariery nabłonkowej, zmian mikrobiomu, metabolizmu, składu wydzieliny czy innych mechanizmów.

Autorzy przywołują również wcześniejsze dane sugerujące możliwe zmiany organizacji claudin-4 – białka uczestniczącego w tworzeniu ścisłych połączeń międzykomórkowych – w określonych modelach komórkowych. Nie pozwala to jednak obecnie stwierdzić, że podobny mechanizm zachodzi u pacjentów leczonych ETI.

IgA i możliwa rola bariery śluzówkowej

Kolejną częścią pracy była analiza zależności pomiędzy stężeniem IgA w surowicy a aktywnością zależną od NF-κB. W grupie PsA+ wykazano istotną statystycznie odwrotną korelację: wyższe stężenie IgA wiązało się z mniejszą aktywnością związaną z bEVs. Na wykresie przedstawionym przez autorów wartość p dla tej zależności wynosiła 0,04.

Analogicznego istotnego związku nie wykazano w grupie PsA-. Dla całej populacji osób z mukowiscydozą zależność miała charakter trendu, ale nie osiągnęła konwencjonalnego progu istotności statystycznej.

IgA jest ważnym elementem odporności błon śluzowych dróg oddechowych i przewodu pokarmowego. Autorzy wskazują na wcześniejsze badania innych chorób zapalnych, w których bakteryjne pęcherzyki mogą być opłaszczane przez IgA. Jedną z hipotez jest więc możliwość wiązania części IgA przez materiał pochodzenia bakteryjnego. W przypadku mukowiscydozy pozostaje to jednak jedynie potencjalnym mechanizmem wymagającym bezpośredniego potwierdzenia.

Najważniejsze ograniczenia badania

Wyniki są interesujące, ale wymagają ostrożnej interpretacji. Jest to pilotażowe badanie obejmujące stosunkowo niewielką liczbę uczestników. Analizy poszczególnych testów obejmowały dodatkowo nieco mniejsze grupy w zależności od dostępności materiału biologicznego.

Najważniejszym ograniczeniem jest brak bezpośredniego potwierdzenia, że analizowany sygnał pochodził z bakteryjnych pęcherzyków określonego gatunku. Funkcjonalny test HEK-Blue wykrywa aktywność materiału zdolnego do pobudzania TLR4, przede wszystkim LPS bakterii Gram-ujemnych. Nie można jednak całkowicie wykluczyć udziału LPS niezwiązanego z pęcherzykami.

Western blot nie pozwolił zidentyfikować OprF ani OmpA w materiale pobranym od pacjentów, mimo że przeciwciała działały prawidłowo w próbkach referencyjnych. Tym samym badanie nie dostarcza dowodu, że zwiększona aktywność w krążeniu u pacjentów PsA+ rzeczywiście pochodzi z pęcherzyków uwalnianych przez P. aeruginosa.

Nie można również ustalić kierunku zależności. Zwiększona aktywność związana z bEVs może być konsekwencją zaburzenia bariery śluzówkowej, ale równie dobrze może stanowić jeden z czynników nasilających stan zapalny. Pilotażowy projekt nie pozwala rozstrzygnąć tej kwestii.

Potencjalne znaczenie diagnostyczne dopiero wymaga potwierdzenia

W przyszłości analiza bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub ich składników mogłaby teoretycznie uzupełniać diagnostykę mikrobiologiczną u osób z mukowiscydozą. Taki kierunek badań może być szczególnie interesujący w erze wysoko skutecznej terapii modulatorami CFTR, kiedy u wielu pacjentów ilość spontanicznie odkrztuszanej plwociny znacząco się zmniejsza.

Do zastosowania klinicznego droga jest jednak daleka. Konieczne są metody pozwalające nie tylko wykrywać materiał bakteryjny, lecz także z dużą czułością i swoistością ustalać jego pochodzenie gatunkowe. Autorzy wskazują między innymi na znakowanie nanocząstek przeciwciałami, metody wykorzystujące cytometrię przepływową oraz immunowychwyt z użyciem odpowiednio przygotowanych nośników.

Potrzebne są ponadto większe, dobrze scharakteryzowane kohorty i badania podłużne umożliwiające sprawdzenie, czy zmiany poziomu bEVs lub aktywności LPS poprzedzają zakażenie, korelują z jego aktywnością, odpowiadają na eradykację albo wiążą się ze zmianami czynności płuc i częstością zaostrzeń.

Co badanie wnosi do wiedzy o mukowiscydozie

Praca zespołu z Erlangen wskazuje na interesujący i dotychczas słabo poznany element relacji pomiędzy mikrobiotą, barierą nabłonkową oraz układem odpornościowym w mukowiscydozie. Wyniki przemawiają za tym, że w krążeniu osób z CF występuje większa aktywność biologiczna związana z produktami bakterii Gram-ujemnych niż u zdrowych osób.

Szczególnie interesujące są obserwacje dotyczące pacjentów PsA+, odwrotnej zależności z IgA oraz terapii ETI. Każda z tych obserwacji wymaga jednak niezależnej weryfikacji. Badanie nie dowodzi bowiem ani pochodzenia pęcherzyków od P. aeruginosa, ani związku przyczynowego pomiędzy ETI a większą obecnością produktów bakteryjnych w krążeniu.

Autorzy podali, że badanie otrzymało finansowanie między innymi z Deutsche Forschungsgemeinschaft oraz programów Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg i Johannes und Frieda Marohn-Stiftung. Alexander Schnell zadeklarował posiadanie opcji na akcje Vertex Pharmaceuticals; pozostali autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

Źródło: Journal of Cystic Fibrosis, Detection of bacterial extracellular vesicles in patients with cystic fibrosis – a pilot study.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcf.2026.07.013