Astma u małych dzieci: analiza oddechu i DNA ma pomóc we wcześniejszym rozpoznaniu choroby

Badacze z Empa i Universitäts-Kinderspital Zürich rozpoczęli projekt, którego celem jest opracowanie nieinwazyjnego protokołu wspomagającego wcześniejsze rozpoznawanie astmy u małych dzieci. W prospektywnej części badania ma uczestniczyć 180 dzieci w wieku od 2 do 4 lat. Naukowcy połączą analizę składu wydychanego powietrza, dane genetyczne i metody uczenia maszynowego. Projekt nie dostarczył jeszcze wyników diagnostycznych i nie oznacza, że nowy test jest dostępny w praktyce klinicznej.

Dlaczego rozpoznawanie astmy u małych dzieci jest trudne?

Astma rozpoczynająca się we wczesnym dzieciństwie stanowi szczególny problem diagnostyczny. Nawracające epizody świszczącego oddechu są częste w wieku przedszkolnym, zwłaszcza w przebiegu zakażeń wirusowych, ale nie każde dziecko z nawracającymi świstami rozwinie utrwalony fenotyp astmy. W praktyce klinicznej konieczne jest zatem odróżnienie dzieci, u których objawy są przejawem astmy, od pacjentów z przemijającymi epizodami obturacji lub inną przyczyną dolegliwości.

Jednocześnie klasyczne metody obiektywizacji zmiennego ograniczenia przepływu wydechowego wymagają współpracy badanego. Wiarygodne wykonanie powtarzalnych manewrów natężonego wydechu jest u dwu-, trzy- lub czterolatka znacznie trudniejsze niż u dziecka w wieku szkolnym. Z tego powodu poszukuje się biomarkerów i metod niewymagających złożonych manewrów oddechowych.

GINA zwraca uwagę, że większość dzieci do 5. roku życia nie jest w stanie wykonywać dostatecznie powtarzalnych manewrów wymaganych w klasycznej spirometrii. W wyspecjalizowanych ośrodkach można jednak stosować również inne techniki. Oscylometria, która ocenia właściwości mechaniczne układu oddechowego podczas spokojnego oddychania, może być wykonywana nawet u części dzieci około 3. roku życia. Żadna z dostępnych metod nie stanowi jednak obecnie pojedynczego, swoistego testu potwierdzającego astmę u dziecka w wieku przedszkolnym.^[1]

Współczesne przeglądy poświęcone medycynie precyzyjnej w tej grupie wiekowej wskazują dlatego na potrzebę łączenia obrazu klinicznego z badaniami czynnościowymi, biomarkerami i – w przyszłości – informacją molekularną. Nadal nie ma jednak pojedynczego biomarkera, który samodzielnie rozstrzygałby, które dziecko z nawracającymi świstami ma astmę i jaki będzie dalszy przebieg choroby.^[2]

Empa i Universitäts-Kinderspital Zürich łączą pulmonologię z analizami molekularnymi

Nowy projekt jest wspólnym przedsięwzięciem Empa – Eidgenössische Materialprüfungs- und Forschungsanstalt oraz Universitäts-Kinderspital Zürich. Ze strony Empa pracami kieruje dr Marija Buljan, zajmująca się analizą danych wieloomicznych i molekularnymi mechanizmami chorób. Zespół prof. Alexandra Möllera z Universitäts-Kinderspital Zürich wnosi doświadczenie z zakresu pulmonologii dziecięcej oraz analiz wydychanego powietrza.

Badacze chcą stworzyć protokół składający się z dwóch zasadniczych elementów. Pierwszym będzie analiza materiału genetycznego pobieranego za pomocą wymazu z jamy ustnej. Drugim – analiza składu wydychanego powietrza z wykorzystaniem wysokorozdzielczej spektrometrii mas z analizatorem czasu przelotu. Dane z obu źródeł mają następnie zostać zintegrowane i przeanalizowane metodami obliczeniowymi.

W pierwszych etapach badacze koncentrują się na identyfikacji cząsteczek obecnych w wydychanym powietrzu, które mogą być związane z późniejszym rozpoznaniem astmy. Dzieci wydychają powietrze do specjalnego worka, a pobrana próbka jest następnie analizowana metodą spektrometrii mas.

Na podstawie powstałych wielowymiarowych profili molekularnych model uczenia maszynowego ma klasyfikować dzieci pod względem prawdopodobieństwa późniejszego rozpoznania astmy. Kiedy uczestnicy osiągną odpowiedni wiek, przewidywania modelu mają zostać porównane z rozpoznaniem ustalonym według stosowanego protokołu diagnostycznego.

Molekularny „odcisk” choroby w wydychanym powietrzu

Wydychane powietrze jest złożoną mieszaniną gazów i substancji pochodzących zarówno z procesów metabolicznych organizmu, jak i ze środowiska. Szczególne zainteresowanie badaczy budzą lotne związki organiczne (LZO; ang. volatile organic compounds, VOCs). Ich zbiorczy profil może odzwierciedlać procesy metaboliczne, stres oksydacyjny oraz zmiany towarzyszące zapaleniu dróg oddechowych.

Analizę dużej liczby metabolitów i związków lotnych obecnych w wydychanym powietrzu określa się niekiedy mianem breathomics. Jej potencjalną zaletą w pediatrii jest bardzo mała inwazyjność. Pobranie próbki nie wymaga wkłucia ani wykonywania serii maksymalnych manewrów wydechowych charakterystycznych dla klasycznej spirometrii.

Koncepcja nie pojawiła się jednak dopiero wraz ze szwajcarskim projektem. We wcześniejszym prospektywnym badaniu Smolinska i wsp. analizowali profile lotnych związków organicznych u 252 dzieci w wieku 2-6 lat. Zidentyfikowano zestaw 17 związków umożliwiający różnicowanie dzieci, u których następnie rozpoznano astmę, od dzieci z przemijającymi świstami. W niezależnym zbiorze testowym uzyskano 80-procentową prawidłowość predykcji.^[3]

Wynik ten był dowodem koncepcji, ale nie doprowadził do wprowadzenia analizy VOC do rutynowej diagnostyki. Jednym z problemów breathomiki jest duża liczba potencjalnych źródeł zmienności. Na skład wydychanego powietrza mogą wpływać m.in. zakażenia, dieta, ekspozycje środowiskowe, mikrobiom, sposób pobierania próbki, warunki jej przechowywania oraz sama platforma analityczna. Model opracowany w jednym ośrodku i na jednej populacji wymaga więc niezależnej walidacji przed zastosowaniem klinicznym.

Dlaczego spektrometria mas?

Spektrometria mas umożliwia rozdzielenie i identyfikację bardzo dużej liczby związków chemicznych obecnych w badanym materiale. W projekcie szwajcarskim wykorzystywany jest wysokorozdzielczy spektrometr mas z analizatorem czasu przelotu. Takie podejście może wygenerować ogromną liczbę cech opisujących pojedynczą próbkę.

To właśnie dlatego konieczne stają się metody uczenia maszynowego. Człowiek nie jest w stanie interpretować tysięcy sygnałów jako niezależnych parametrów diagnostycznych. Algorytm może natomiast poszukiwać ich kombinacji tworzących powtarzalny profil związany z określonym fenotypem klinicznym.

Od wymazu z jamy ustnej do panelu wariantów genetycznych

Druga część projektu koncentruje się na genetycznej składowej astmy. Choroba ma złożone podłoże wieloczynnikowe. Nie istnieje jeden „gen astmy”, a ryzyko jest wynikiem współdziałania wielu wariantów genetycznych z czynnikami środowiskowymi i procesami zachodzącymi w rozwijającym się układzie oddechowym.

W badaniach nad astmą rozpoczynającą się w dzieciństwie szczególną uwagę zwracano m.in. na region chromosomu 17q obejmujący ORMDL3 i GSDMB, a także na CDHR3, IL33 i inne loci związane z funkcją nabłonka dróg oddechowych oraz odpowiedzią immunologiczną.^[4] Nie oznacza to jednak, że właśnie te geny zostaną wykorzystane w panelu opracowywanym przez zespół Empa. Informacja prasowa nie wymienia konkretnych wariantów przewidzianych do końcowego testu.

Badacze z Empa zamierzają najpierw wykorzystać model komputerowy do zbudowania mapy komórkowych szlaków sygnałowych. Szczególna uwaga ma być poświęcona komórkom układu odpornościowego uczestniczącym w patogenezie astmy dziecięcej. Następnie wybrane procesy mają być weryfikowane eksperymentalnie, aby wskazać geny mogące odgrywać istotną rolę w badanych szlakach.

Kolejnym krokiem ma być stworzenie zawężonego panelu wariantów genetycznych. Według przedstawionego planu na późniejszym etapie wymazy z jamy ustnej zostaną pobrane również od około 12 par rodzic-dziecko, w których dziecko ma już rozpoznaną astmę. Dane te mają służyć dalszej ocenie obecności wytypowanych wariantów.

Z perspektywy metodologicznej będzie to etap wymagający szczególnej ostrożności. Astma jest heterogeniczną chorobą wielogenową, dlatego przydatność diagnostyczna panelu nie może być oceniana wyłącznie na podstawie biologicznej wiarygodności wybranych genów. Konieczne będzie wykazanie, że dodanie informacji genetycznej rzeczywiście poprawia klasyfikację ryzyka ponad dane kliniczne i inne dostępne biomarkery, a następnie potwierdzenie wyników w niezależnych populacjach.

Multi-omics i uczenie maszynowe: dlaczego połączenie danych może być ważniejsze niż pojedynczy biomarker?

Najbardziej interesującym elementem projektu nie jest sama analiza wydychanego powietrza ani samo badanie DNA, lecz próba ich integracji. Podejście multiomiczne zakłada, że złożonej choroby nie należy opisywać jednym parametrem. Zamiast tego analizowane są równocześnie różne warstwy biologiczne i poszukuje się wzorców powiązanych z fenotypem klinicznym.

W przypadku astmy dziecięcej ma to szczególne uzasadnienie. Pod wspólnym rozpoznaniem astmy mieszczą się odmienne fenotypy i endotypy choroby. Podobny objaw, na przykład świszczący oddech, może pojawiać się u dzieci o odmiennym profilu zapalenia, różnej podatności genetycznej i różnym dalszym przebiegu klinicznym.^[2][4]

Model obejmujący dane z wydychanego powietrza, warianty genetyczne oraz informacje kliniczne mógłby teoretycznie wychwytywać subtelne kombinacje cech, których nie widać przy analizie każdego parametru oddzielnie. Jednocześnie im większa liczba analizowanych zmiennych w stosunku do liczby uczestników, tym większe znaczenie mają prawidłowa walidacja modelu, zabezpieczenie przed przeuczeniem oraz sprawdzenie jego działania na danych pochodzących spoza kohorty użytej do opracowania algorytmu.

Od klasyfikacji statystycznej do użytecznego testu klinicznego jest daleka droga

Dobra separacja grup w zbiorze badawczym nie jest jeszcze równoznaczna z przydatnością diagnostyczną. W przyszłej ocenie protokołu potrzebne będą m.in. dane o czułości, swoistości, dodatniej i ujemnej wartości predykcyjnej, kalibracji modelu oraz jego działaniu w populacji o rzeczywistej częstości występowania choroby.

Istotne będzie również porównanie nowego rozwiązania z aktualnym postępowaniem klinicznym. Test ma największą wartość wtedy, gdy dostarcza informacji, której nie można uzyskać równie skutecznie z wywiadu, badania przedmiotowego, oceny odpowiedzi na leczenie i dostępnych badań czynnościowych lub biomarkerów.

Co projekt może oznaczać dla praktyki klinicznej?

Jeżeli wieloomiczny protokół okaże się wiarygodny, powtarzalny i odpowiednio zwalidowany, potencjalnie mógłby wspomagać decyzje w jednej z najtrudniejszych diagnostycznie grup – u dzieci w wieku przedszkolnym z nawracającymi epizodami obturacji i świstów.

Nie chodzi wyłącznie o wcześniejsze identyfikowanie dzieci z astmą. Równie istotne byłoby ograniczenie nadrozpoznawalności choroby u dzieci, których nawracające objawy mają inne podłoże. Właściwa klasyfikacja mogłaby w przyszłości pomóc w bardziej precyzyjnym kwalifikowaniu pacjentów do leczenia przeciwzapalnego i dalszej obserwacji.

Nie oznacza to jednak, że obecne leczenie można sprowadzać do „leczenia objawowego kortyzonem”, jak sugeruje uproszczony opis w informacji prasowej. Wziewne glikokortykosteroidy (wGKS; ang. inhaled corticosteroids, ICS) są podstawowymi lekami przeciwzapalnymi w astmie. U małych dzieci odpowiedź na próbę leczenia wGKS jest ponadto jednym z elementów wykorzystywanych w procesie diagnostycznym zgodnie z GINA.^[1]

Dlatego nawet bardzo obiecujący biomarker nie powinien być rozpatrywany jako prosty zamiennik całej oceny klinicznej. Docelowo jego rolą byłoby raczej zwiększenie pewności diagnostycznej i umożliwienie bardziej precyzyjnej stratyfikacji pacjentów.

Perspektywa pięciu do dziesięciu lat

Według informacji przekazanych przez zespół badawczy, jeżeli projekt zakończy się powodzeniem, od rozpoczęcia obecnych prac do ustalenia protokołu i jego potencjalnego zakorzenienia w medycynie dziecięcej może upłynąć około 5-10 lat. Jest to szacunek badaczy, a nie termin wprowadzenia konkretnego wyrobu diagnostycznego.

Projekt został zaplanowany na cztery lata i podzielony na pięć faz. Finansowanie umożliwiły Blumenau-Léonie Hartmann-Stiftung, Thomas und Doris Ammann Stiftung oraz dwie inne fundacje, których nazw nie podano w materiale prasowym.