Nanocząstki srebra jako narzędzie do precyzyjnego cięcia zmodyfikowanego DNA i składania długich fragmentów genetycznych

Japoński zespół badawczy opisał metodę miejscowo swoistego cięcia chemicznie zmodyfikowanych oligonukleotydów z użyciem nanocząstek srebra. Rozwiązanie może mieć znaczenie dla biologii syntetycznej, chemii kwasów nukleinowych i technologii składania długich fragmentów DNA, ponieważ umożliwia otrzymywanie końców kohezyjnych, czyli tzw. lepkich końców, o zaprojektowanej długości nawisu oraz ich późniejszą ligację z udziałem ligazy DNA.

W artykule:

• na czym polega cięcie DNA indukowane przez nanocząstki srebra,
• dlaczego klasyczne użycie azotanu srebra ogranicza praktyczne zastosowanie tej reakcji,
• jak modyfikacja PEG zwiększa aktywność nanocząstek srebra,
• jak badacze uzyskali końce kohezyjne DNA i połączyli fragmenty w dłuższe konstrukty,
• jak zbudowano DNA kodujące GFP i potwierdzono ekspresję białka w komórkach HeLa,
• jakie zastosowania może mieć ta metoda w biotechnologii i biologii syntetycznej.

Nowa chemiczna metoda pracy z DNA

W artykule opublikowanym w czasopiśmie Nucleic Acids Research badacze z Japonii przedstawili metodę miejscowo swoistego cięcia nici oligonukleotydów, w której kluczową rolę odgrywają nanocząstki srebra, czyli AgNPs. Autorami pracy są Masahito Inagaki, Mikiya Kase, Haruka Hiraoka, Natsuhisa Oka, Fumitaka Hashiya, Naoko Abe, Yasuaki Kimura oraz Hiroshi Abe. Zespół reprezentował między innymi Department of Chemistry, Graduate School of Science, Nagoya University, Department of Chemistry and Biomolecular Science, Faculty of Engineering, Gifu University, Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Gifu University, Center for One Medicine Innovative Translational Research (COMIT), Institute for Advanced Study, Gifu University, Research Center for Materials Science, Nagoya University oraz CREST, Japan Science and Technology Agency.

Praca dotyczy jednego z ważnych problemów technicznych współczesnej chemii kwasów nukleinowych i biologii syntetycznej: jak precyzyjnie przecinać DNA w zaplanowanym miejscu, tak aby otrzymać fragmenty gotowe do dalszego składania w dłuższe konstrukty. Metody enzymatyczne, takie jak Golden Gate assembly czy Gibson assembly, są obecnie podstawowymi narzędziami inżynierii genetycznej, jednak ich zastosowanie zależy od rozpoznawania sekwencji przez enzymy oraz od sprawności późniejszej ligacji. Autorzy badania zaproponowali alternatywne podejście chemiczne, w którym miejsce przecięcia jest definiowane przez wcześniejsze wprowadzenie do DNA specjalnego wiązania 3′-fosforotiolanowego.

W uproszczeniu metoda polega na tym, że do starterów PCR wprowadza się zmodyfikowane wiązanie chemiczne, które po amplifikacji znajduje się w ściśle zaplanowanym miejscu produktu DNA. Następnie nanocząstki srebra indukują hydrolizę tego wiązania, prowadząc do przecięcia nici i wytworzenia fragmentów DNA z końcami przydatnymi do dalszej ligacji. Szczególnie istotne jest to, że technologia może generować końce kohezyjne o długości nawisu projektowanej przez badacza, a nie tylko końce wynikające z właściwości danego enzymu restrykcyjnego.

Dlaczego potrzebne są nowe metody cięcia oligonukleotydów

Rozwój technologii edycji genomu, syntezy DNA i składania długich konstruktów genetycznych zwiększył zapotrzebowanie na metody, które umożliwiają dokładne, przewidywalne i wydajne przygotowywanie fragmentów DNA. Autorzy pracy zwracają uwagę, że kontrolowane cięcie nici DNA jest istotne między innymi dla tworzenia modeli zwierzęcych, badań nad chorobami genetycznymi, opracowywania narzędzi edycji genomu, biologii syntetycznej oraz konstrukcji bibliotek sekwencji DNA.

Metody enzymatyczne, w tym klasyczne trawienie restrykcyjne, Golden Gate assembly i Gibson assembly, mają ogromne znaczenie praktyczne, ale nie zawsze dają pełną swobodę projektowania. Enzymy restrykcyjne rozpoznają określone sekwencje, a długość i charakter uzyskanych końców są zwykle ograniczone przez właściwości danego enzymu. Oznacza to, że konstrukcja DNA musi uwzględniać obecność lub brak odpowiednich miejsc restrykcyjnych, a w niektórych układach może to komplikować projektowanie.

Alternatywą są chemiczne metody cięcia nici DNA. W literaturze opisano między innymi systemy oparte na depirymidynacji, oksydacyjnym cięciu wiązań fosforotioatowych oraz reakcjach z udziałem uracil DNA glycosylase. Każde z tych rozwiązań ma jednak ograniczenia. Niektóre wymagają stosunkowo ostrych warunków, inne generują mieszaniny produktów lub wymagają obecności określonych zasad w miejscu cięcia. Autorzy omawianej pracy skoncentrowali się na wiązaniu 3′-fosforotiolanowym, które może być przecinane w sposób miejscowo swoisty i nie narzuca tak silnych ograniczeń sekwencyjnych.

Problem azotanu srebra i utraty produktu DNA

Wcześniejsze badania Cossticka oraz Vyle’a i współpracowników wykazały, że DNA zawierające wiązanie 3′-fosforotiolanowe może być szybko przecinane przez azotan srebra. Reakcja zachodziła w łagodnych warunkach, nawet w temperaturze pokojowej, i prowadziła do uzyskania pożądanego produktu z końcem 5′-fosforanowym. Teoretycznie była więc atrakcyjnym kandydatem do przygotowywania fragmentów DNA z końcami kohezyjnymi.

Praktyczny problem pojawiał się jednak po zakończeniu reakcji. Jony srebra trzeba było usunąć z mieszaniny, ponieważ mogłyby zakłócać dalsze etapy pracy z DNA, zwłaszcza ligację. Autorzy testowali usuwanie jonów srebra przez dodanie związków tiolowych, takich jak ditiotreitol, czyli DTT, lub etanotiol. Powodowało to wytrącenie kompleksów srebro–tiol, ale jednocześnie prowadziło do współstrącania znacznej części przeciętego DNA.

W eksperymentach opisanych w artykule całkowita ilość DNA w jednej reakcji wynosiła 220 pmol, natomiast po zastosowaniu związków tiolowych odzyskiwano jedynie 92 pmol produktu przy użyciu DTT oraz 88 pmol przy użyciu etanotiolu. Oznaczało to utratę około 60% przeciętego DNA. W osobnym porównaniu, wykonanym na skali 244 pmol, po zastosowaniu azotanu srebra odzyskano 35,1 pmol produktu, czyli jedynie 14,4%.

Rola nanocząstek srebra w nowym podejściu

Autorzy zaproponowali, aby zamiast rozpuszczalnych jonów srebra zastosować nanocząstki srebra. Założenie było następujące: powierzchnia nanocząstki srebra może działać jak kwas Lewisa, aktywując wiązanie 3′-fosforotiolanowe w DNA i indukując jego hydrolizę. W efekcie powstają dwa fragmenty: jeden z końcem 3′-tiolowym oraz drugi z końcem 5′-fosforanowym. Fragment zawierający grupę tiolową może wiązać się z powierzchnią nanocząstki, natomiast drugi fragment pozostaje w roztworze wodnym i może zostać wykorzystany w dalszych etapach.

Najważniejszą zaletą takiego układu jest możliwość fizycznego oddzielenia nanocząstek od roztworu przez wirowanie. Zamiast wytrącać srebro chemicznie i tracić znaczną część DNA, badacz może odwirować nanocząstki, zebrać supernatant i odzyskać pożądany fragment. W eksperymentach porównawczych zastosowanie nanocząstek srebra pozwoliło odzyskać 240 pmol produktu z 244 pmol wyjściowej ilości DNA, co odpowiadało wydajności odzysku 98,4%.

W pierwszym etapie zespół analizował wpływ rozmiaru nanocząstek na aktywność cięcia. Testowano nanocząstki srebra o średnicy 10, 20 i 100 nm. Reakcję prowadzono przez 31 godzin w temperaturze 37°C, a wyniki oceniano metodą denaturującej elektroforezy poliakrylamidowej. Zgodnie z przewidywaniami, mniejsze nanocząstki wykazywały większą aktywność, najpewniej ze względu na korzystniejszy stosunek powierzchni do objętości. Wydajność cięcia wyniosła 35,9% dla nanocząstek 10 nm, 21,9% dla nanocząstek 20 nm oraz 13,1% dla nanocząstek 100 nm.

Badacze ocenili także wpływ czasu i temperatury. Dla nanocząstek o średnicy 10 nm cięcie przy 70°C postępowało stopniowo, a po 2 godzinach osiągało około 50%. Podniesienie temperatury do 95°C znacząco zwiększało wydajność i po 2 godzinach prowadziło do niemal ilościowego przecięcia DNA. Tak wysoka temperatura może jednak sprzyjać nieswoistej degradacji dłuższych fragmentów DNA, dlatego autorzy poszukiwali sposobu zwiększenia aktywności nanocząstek w łagodniejszych warunkach.

Modyfikacja PEG znacząco zwiększa aktywność cięcia

Kluczowym elementem optymalizacji była modyfikacja powierzchni nanocząstek srebra polietylenoglikolem, czyli PEG. Autorzy wykorzystali tiolowo zakończony PEG o średniej masie cząsteczkowej 5000, który może wiązać się z powierzchnią srebra. Tak przygotowane PEGylowane nanocząstki srebra miały większą stabilność w środowisku wodnym, lepszą dyspersję oraz mniejszą podatność na niekorzystne zmiany powierzchniowe.

Efekt PEGylacji był bardzo wyraźny. W reakcji prowadzonej przez 31 godzin w temperaturze 37°C nanocząstki srebra o średnicy 10 nm bez modyfikacji PEG dawały 35,9% przecięcia DNA, natomiast PEGylowane nanocząstki srebra osiągały 91,8%. Oznaczało to ponad dwukrotną poprawę aktywności cięcia przy zachowaniu tej samej klasy nanocząstek.

Jeszcze bardziej praktyczne znaczenie miały eksperymenty prowadzone w temperaturze 50°C. PEGylowane nanocząstki srebra o średnicy 10 nm powodowały narastające cięcie DNA wraz z czasem reakcji, a po 60 minutach osiągano ponad 90% przecięcia. W praktyce oznacza to, że odpowiednia modyfikacja powierzchni pozwalała przeprowadzić reakcję w warunkach znacznie łagodniejszych niż 95°C, co jest istotne przy pracy z dłuższymi fragmentami DNA.

Charakterystyka nanocząstek po PEGylacji i po cięciu DNA

Autorzy wykonali dodatkowe pomiary fizykochemiczne, aby sprawdzić, jak zmienia się powierzchnia nanocząstek przed i po PEGylacji oraz po reakcji cięcia DNA. Wykorzystano dynamiczne rozpraszanie światła, czyli DLS, oraz ocenę potencjału ζ. Dane te pozwalają wnioskować o rozmiarze cząstek, rozkładzie ich wielkości i ładunku powierzchniowym.

Komercyjne nanocząstki srebra deklarowane jako 10 nm miały w pomiarach średnicę 11,42 nm, natomiast nanocząstki 20 nm miały średnicę 19,23 nm. Po PEGylacji rozmiar cząstek wzrastał odpowiednio do 22,22 nm dla nanocząstek 10 nm oraz do 34,33 nm dla nanocząstek 20 nm. Jednocześnie potencjał ζ przesuwał się w kierunku wartości bliższych neutralnym. Dla nanocząstek 10 nm zmieniał się z -31,72 mV do -6,83 mV, a dla nanocząstek 20 nm z -28,25 mV do -2,63 mV. Jest to zgodne z ekranowaniem ładunku powierzchniowego przez neutralne łańcuchy PEG.

Po reakcji cięcia DNA obserwowano wzrost rozmiaru cząstek i przesunięcie potencjału ζ w kierunku bardziej ujemnym. Autorzy interpretują to jako dowód, że fragmenty DNA powstające w wyniku cięcia wiązały się z powierzchnią nanocząstek. Ujemny ładunek pochodził z fosfodiestrowego szkieletu DNA. Dane DLS wspierały więc model, zgodnie z którym część produktu pozostaje wychwycona przez powierzchnię AgNP, a pożądany fragment może być odzyskany z supernatantu.

Badacze ocenili również możliwy udział resztkowych jonów srebra obecnych w dyspersji nanocząstek. Stężenie jonów srebra oszacowano na około 12 ppm, jednak zastosowana metoda kolorymetryczna z 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyną nie pozwalała jednoznacznie odróżnić jonów swobodnych od srebra dostępnego na powierzchni nanocząstek. Autorzy ostrożnie wskazują więc, że w reakcji mogą uczestniczyć zarówno powierzchnia nanocząstek, jak i resztkowe jony srebra, ale zależność aktywności od rozmiaru nanocząstek oraz zmiany po reakcji przemawiają za dominującą rolą powierzchni AgNP.

Przygotowanie końców kohezyjnych DNA

Aby metoda była przydatna w składaniu długiego DNA, zmodyfikowane oligonukleotydy musiały spełnić dwa warunki. Po pierwsze, startery zawierające wiązanie 3′-fosforotiolanowe musiały być akceptowane przez polimerazy stosowane w PCR. Po drugie, po amplifikacji uzyskane dwuniciowe DNA musiało dać się przeciąć w przewidzianym miejscu w celu wytworzenia końców kohezyjnych.

Autorzy wykonali eksperymenty wydłużania startera z użyciem kilku polimeraz: KOD-Plus-Neo, PrimeSTAR HS, Phusion High Fidelity, Q5 High Fidelity, Deep Vent oraz Taq DNA polymerase. We wszystkich przypadkach uzyskano pełnej długości produkt wydłużania, bez widocznego zatrzymania reakcji na zmodyfikowanym miejscu. Oznaczało to, że obecność wiązania 3′-fosforotiolanowego nie uniemożliwia rozpoznania matrycy przez testowane polimerazy.

Następnie badacze sprawdzili, czy PEGylowane nanocząstki srebra mogą przecinać nie tylko jednoniciowe, ale również dwuniciowe DNA. Zaprojektowano 20-nukleotydowy dupleks, w którym wiązanie 3′-fosforotiolanowe znajdowało się między piątą a szóstą zasadą od końca 5′. Taki układ po przecięciu miał tworzyć koniec kohezyjny z pięcionukleotydowym nawisem. W obecności nici komplementarnej aktywność była nieco niższa niż dla pojedynczej nici, ale po 2 godzinach uzyskiwano ponad 90% przecięcia. Potwierdziło to możliwość wytwarzania końców kohezyjnych w produktach dwuniciowego DNA.

Składanie dłuższych fragmentów DNA

Najważniejszą częścią pracy było sprawdzenie, czy chemicznie przygotowane końce kohezyjne rzeczywiście poprawiają ligację fragmentów DNA. Badacze zaprojektowali startery PCR zawierające wiązania 3′-fosforotiolanowe w takich pozycjach, aby po amplifikacji i obróbce nanocząstkami srebra uzyskać końce kohezyjne z ośmionukleotydowym nawisem. Jako kontrolę wykorzystano trawienie enzymem BsaI, które generowało czteronukleotydowe nawisy.

Z użyciem starterów 3S-DNA3 i 3S-DNA4 oraz polimerazy KOD-Plus-Neo otrzymano dwa produkty PCR o długości 298 par zasad i 558 par zasad. Po oczyszczeniu potraktowano je PEGylowanymi nanocząstkami srebra w temperaturze 50°C przez 1–4 godziny. Następnie fragmenty połączono z użyciem T4 DNA ligase w temperaturze 25°C przez 3 godziny. Analiza w żelu agarozowym wykazała powstanie produktu ligacji o długości 848 par zasad.

Wydajność ligacji rosła wraz z czasem obróbki AgNP. Po 1 godzinie wynosiła około 22%, po 2 godzinach 26%, a po 3 i 4 godzinach około 27%. Dla porównania, fragmenty przygotowane metodą BsaI, z czteronukleotydowymi końcami kohezyjnymi, osiągały wydajność około 14%. Wyniki sugerują, że dłuższe nawisy mogą zwiększać skuteczność łączenia fragmentów DNA, prawdopodobnie dzięki bardziej stabilnemu parowaniu końców przed etapem ligacji enzymatycznej.

Konstrukcja DNA kodującego GFP i ekspresja w komórkach HeLa

Aby sprawdzić funkcjonalność metody w bardziej biologicznie istotnym układzie, autorzy przygotowali konstrukt DNA kodujący białko GFP. W tym celu amplifikowano dwa fragmenty: fragment zawierający promotor CMV oraz fragment zawierający sekwencję kodującą GFP. Startery zaprojektowano tak, aby po obróbce nanocząstkami srebra tworzyły końce kohezyjne z nawisem 10- lub 18-nukleotydowym. Jako kontrolę zastosowano również fragmenty przygotowane przez BsaI, z czteronukleotydowym nawisem.

Fragment promotora CMV miał długość około 828–832 par zasad, natomiast fragment kodujący GFP około 1252–1264 par zasad, zależnie od zastosowanego zestawu starterów. Po PCR produkty oczyszczano, poddawano obróbce PEGylowanymi nanocząstkami srebra w temperaturze 50°C przez 4 godziny, a następnie rozcieńczano i ogrzewano w 90°C przez 5 minut, aby ułatwić oddysocjowanie przeciętych fragmentów od produktów PCR. Po liofilizacji i annealingu dodawano T4 DNA ligase i prowadzono ligację.

Wyniki były wyraźne. Dla fragmentów z 18-nukleotydowym nawisem, przygotowanych z udziałem AgNP, wydajność ligacji wynosiła około 44%. Dla fragmentów z 10-nukleotydowym nawisem wynosiła około 39%. Fragmenty kontrolne przygotowane przez BsaI osiągały niższą wydajność: około 8% w obecności AgNP i około 16% bez AgNP. Autorzy sugerują, że obecność nanocząstek może częściowo maskować końce kohezyjne lub oddziaływać z DNA, obniżając ligację w układzie kontrolnym, natomiast dłuższe nawisy uzyskane metodą chemiczną kompensują ten efekt i prowadzą do wyższej wydajności.

Następnie mieszaniny po ligacji transfekowano do komórek HeLa z użyciem Lipofectamine 3000. Po 24 godzinach od transfekcji obserwowano fluorescencję GFP. Obecność komórek GFP-dodatnich potwierdzała, że ligowane fragmenty mogły tworzyć funkcjonalny konstrukt zdolny do ekspresji białka. Liczba komórek GFP-dodatnich wydawała się odzwierciedlać wydajność ligacji, co dodatkowo wspierało praktyczną użyteczność metody.

Znaczenie wyników dla biologii syntetycznej

Przedstawiona metoda ma kilka cech, które mogą być istotne dla dalszego rozwoju technologii składania DNA. Po pierwsze, miejsce cięcia jest definiowane chemicznie przez wprowadzenie wiązania 3′-fosforotiolanowego, co daje dużą swobodę projektowania. Po drugie, nanocząstki srebra można łatwo usunąć przez wirowanie, a odzysk produktu jest znacznie lepszy niż w przypadku reakcji z azotanem srebra. Po trzecie, PEGylacja nanocząstek znacząco poprawia ich aktywność w łagodniejszych warunkach temperaturowych. Po czwarte, metoda pozwala uzyskiwać dłuższe końce kohezyjne niż typowe trawienie restrykcyjne, co może poprawiać wydajność ligacji.

Z punktu widzenia biologii syntetycznej interesujące jest również to, że autorzy nie ograniczyli się do krótkich modelowych oligonukleotydów. Pokazali ligację fragmentów prowadzącą do DNA o długości 848 par zasad oraz konstrukcję większego układu o długości 2074 par zasad, obejmującego promotor CMV i sekwencję kodującą GFP. Udowodnili także funkcjonalność produktu w komórkach ssaczych, co wzmacnia znaczenie pracy jako dowodu koncepcji.

Metoda nie jest jeszcze gotowym, uniwersalnym zamiennikiem istniejących platform składania DNA. Autorzy sami wskazują przestrzeń do dalszej optymalizacji, między innymi w zakresie usuwania nanocząstek po cięciu, poprawy ligacji oraz zastosowania technologii do jeszcze dłuższych konstruktów. Niemniej wyniki pokazują, że chemia nanocząstek metali może zostać wykorzystana jako narzędzie do manipulacji kwasami nukleinowymi, a nie jedynie jako element diagnostyki, obrazowania czy nanomateriałów.

Ograniczenia i kierunki dalszych badań

Choć wyniki są obiecujące, metoda wymaga dalszego rozwoju. Po pierwsze, przygotowanie starterów zawierających wiązania 3′-fosforotiolanowe wymaga specjalistycznej syntezy chemicznej. Autorzy opisali syntezę odpowiednich 3′-tionukleozydowych fosforamidytów oraz wykorzystanie automatycznej syntezy DNA, ale nie jest to procedura równie rutynowa jak zamówienie standardowych starterów PCR. Po drugie, w przypadku dłuższych końców kohezyjnych, takich jak 18-nukleotydowe nawisy, pełne i jednorodne przygotowanie końców może być trudniejsze, co może częściowo redukować korzyść wynikającą z większej długości nawisu.

Po trzecie, obecność AgNP w mieszaninie reakcyjnej może oddziaływać z DNA i wpływać na ligację. W doświadczeniach kontrolnych fragmenty BsaI ligowane w obecności AgNP dawały niższą wydajność niż fragmenty BsaI ligowane bez AgNP. Sugeruje to, że dodatkowe oczyszczanie produktów po cięciu mogłoby jeszcze poprawić wydajność całego procesu. Po czwarte, autorzy wskazują, że mechanizm reakcji może obejmować zarówno powierzchnię nanocząstek, jak i resztkowe jony srebra, dlatego dalsze prace mechanistyczne mogą pomóc w pełniejszym zrozumieniu i kontroli reakcji.

W przyszłości metoda może zostać wykorzystana do syntezy konstruktów DNA w skali genomowej, do przygotowywania bibliotek losowych sekwencji DNA oraz do prac nad lekami i nanomateriałami opartymi na DNA. Szczególnie interesujące może być zastosowanie jej tam, gdzie istotna jest swoboda projektowania długości i sekwencji końców kohezyjnych, a klasyczne enzymy restrykcyjne ograniczają projektowanie do określonych miejsc rozpoznawania i charakterystycznych produktów trawienia.

Podsumowanie

Badanie Masahito Inagakiego, Mikiyi Kase, Haruki Hiraoki, Natsuhisy Oki, Fumitaki Hashiyi, Naoko Abe, Yasuakiego Kimury i Hiroshiego Abe pokazuje, że nanocząstki srebra mogą indukować miejscowo swoiste cięcie chemicznie zmodyfikowanych oligonukleotydów zawierających wiązania 3′-fosforotiolanowe. PEGylacja nanocząstek znacząco zwiększa aktywność reakcji, pozwalając osiągnąć wysoką wydajność cięcia w łagodniejszych warunkach temperaturowych.

Najważniejszym osiągnięciem pracy jest wykazanie, że metoda nie ogranicza się do reakcji modelowych, lecz może być zastosowana do przygotowywania końców kohezyjnych produktów PCR, ligacji fragmentów DNA oraz konstrukcji funkcjonalnego DNA kodującego GFP. W porównaniu z klasycznym podejściem opartym na azotanie srebra nanocząstki umożliwiają znacznie lepszy odzysk przeciętego produktu DNA. W porównaniu z enzymami restrykcyjnymi pozwalają natomiast projektować końce kohezyjne o określonej długości nawisu, w zakresie możliwym dla danego układu reakcyjnego, co może zwiększać wydajność składania fragmentów.

Źródło: Nucleic Acids Research, Silver nanoparticle-induced site-specific strand cleavage of chemically modified oligonucleotides for long-chain DNA assembly. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkag525

„`

**5 alternatywnych tytułów:**

1. Nanocząstki srebra precyzyjnie przecinają zmodyfikowane DNA i ułatwiają składanie długich konstruktów
2. Nowa metoda chemicznego cięcia DNA z użyciem PEGylowanych nanocząstek srebra
3. Srebrne nanocząstki pomagają tworzyć końce kohezyjne DNA do wydajniejszej ligacji
4. Chemiczne składanie DNA: AgNP umożliwiają projektowanie dłuższych końców kohezyjnych
5. Japońscy badacze pokazali, jak nanocząstki srebra mogą wspierać biologię syntetyczną

**5 dłuższych podtytułów:**

1. Badacze z Nagoya University i Gifu University opracowali metodę miejscowo swoistego cięcia oligonukleotydów zawierających wiązania 3′-fosforotiolanowe.
2. PEGylowane nanocząstki srebra zwiększały wydajność reakcji i pozwalały odzyskać przecięty fragment DNA znacznie skuteczniej niż klasyczny azotan srebra.
3. Nowe podejście umożliwiło przygotowanie końców kohezyjnych o zaprojektowanej długości nawisu oraz ligację fragmentów DNA o długości setek i tysięcy par zasad.
4. Zespół potwierdził funkcjonalność technologii, konstruując DNA kodujące GFP i uzyskując ekspresję białka w komórkach HeLa.
5. Metoda może rozszerzyć narzędzia biologii syntetycznej, szczególnie tam, gdzie klasyczne enzymy restrykcyjne ograniczają swobodę projektowania DNA.

**Tagi SEO:** nanocząstki srebra, AgNP, DNA, oligonukleotydy, biologia syntetyczna, chemia kwasów nukleinowych

**Kategorie tematyczne:** biotechnologia, biologia molekularna