Analiza lotnych metabolitów bakterii ma usprawnić dobór bakteriofagów w leczeniu zakażeń Pseudomonas aeruginosa u chorych na mukowiscydozę

Czy na podstawie związków chemicznych uwalnianych przez bakterie można przewidzieć, które bakteriofagi będą najskuteczniejsze przeciwko określonemu szczepowi Pseudomonas aeruginosa? Na to pytanie zamierzają odpowiedzieć naukowcy z Universitätsmedizin Frankfurt i Netherlands Institute of Ecology (NIOO-KNAW). W nowym projekcie wykorzystają analizę lotnych związków organicznych (VOC) oraz metody uczenia maszynowego do poszukiwania biomarkerów przydatnych w personalizacji terapii fagowej u osób z mukowiscydozą. Badania będą prowadzone na izolatach bakteryjnych pochodzących z biobanków, a ich celem jest opracowanie podstaw metody, która w przyszłości mogłaby wspomagać dobór bakteriofagów i monitorowanie odpowiedzi na leczenie.

Dlaczego przewlekłe zakażenia Pseudomonas aeruginosa pozostają wyzwaniem w mukowiscydozie?

Przewlekłe zakażenie dolnych dróg oddechowych wywołane przez Pseudomonas aeruginosa należy do najważniejszych problemów klinicznych w pulmonologii mukowiscydozy. Drobnoustrój ten wykazuje znaczną zdolność adaptacji do środowiska dróg oddechowych, utrzymywania się w przewlekle zakażonych tkankach oraz nabywania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

W przebiegu długotrwałego zakażenia dochodzi do selekcji subpopulacji bakterii o odmiennych właściwościach fenotypowych i genetycznych. Zmiany te mogą obejmować wytwarzanie czynników wirulencji, ruchliwość, produkcję substancji zewnątrzkomórkowych, zdolność tworzenia biofilmu oraz podatność na antybiotyki.

W konsekwencji izolaty pochodzące od tej samej osoby mogą z czasem istotnie różnić się pod względem biologicznym. Dodatkowo w drogach oddechowych jednego chorego mogą równocześnie występować subpopulacje P. aeruginosa wykazujące odmienne właściwości.

Powoduje to trudności w doborze leczenia przeciwbakteryjnego, szczególnie w przypadku szczepów wielolekoopornych. Pomimo postępów w leczeniu przyczynowym mukowiscydozy, w tym stosowania modulatorów CFTR, przewlekłe zakażenia bakteryjne nadal wymagają indywidualnej oceny mikrobiologicznej i klinicznej.

Dlaczego bakteriofagi są rozpatrywane jako uzupełnienie antybiotykoterapii?

Bakteriofagi to wirusy zakażające komórki bakteryjne. W terapii przeciwbakteryjnej wykorzystuje się przede wszystkim fagi lityczne, zdolne do namnażania się w podatnych bakteriach i powodowania ich lizy.

Ich mechanizm działania różni się od mechanizmów stosowanych antybiotyków. Z tego powodu bakteriofagi mogą zachowywać aktywność przeciwko niektórym szczepom opornym na wiele klas leków przeciwbakteryjnych.

Jedną z najważniejszych cech fagoterapii jest jednak wysoka swoistość biologiczna. Określony bakteriofag może wykazywać aktywność jedynie wobec części szczepów należących do tego samego gatunku bakterii.

Oznacza to, że samo rozpoznanie zakażenia Pseudomonas aeruginosa nie wystarcza do wyboru odpowiedniego preparatu fagowego. Konieczna jest ocena podatności izolatu bakteryjnego na konkretny fag lub mieszaninę fagów.

W praktyce laboratoryjnej wymaga to identyfikacji drobnoustroju oraz przeprowadzenia odpowiednich badań mikrobiologicznych. Proces ten może być czasochłonny, a jego dodatkowym utrudnieniem jest możliwość zmiany podatności bakterii w trakcie leczenia.

Założenia projektu realizowanego we Frankfurcie i Wageningen

21 października 2026 roku Mukoviszidose e.V. poinformował o finansowaniu projektu badawczego zatytułowanego „Optimierte Phagentherapie bei Mukoviszidose durch nicht-invasive, auf flüchtigen organischen Verbindungen basierende Diagnostik”.

Przedsięwzięciem kieruje dr Olaf Tyc z Universitätsmedizin Frankfurt. Partnerem naukowym jest prof. dr Paolina Garbeva z Department of Microbial Ecology w Netherlands Institute of Ecology (NIOO-KNAW) w Wageningen.

Projekt finansuje niemiecka organizacja Mukoviszidose e.V. Przyznane dofinansowanie wynosi 19 985 euro, a zaplanowany czas realizacji to 12 miesięcy.

Głównym celem jest ustalenie, czy charakterystyka lotnych metabolitów uwalnianych przez P. aeruginosa może dostarczać informacji przydatnych podczas personalizowania fagoterapii.

Materiał biologiczny i zakres planowanych analiz

Badacze zamierzają wykorzystać izolaty P. aeruginosa uzyskane od osób z mukowiscydozą w przebiegu wcześniejszej terapii bakteriofagowej. Materiał jest dostępny w biobankach, dlatego projekt nie wymaga rekrutowania nowych pacjentów.

Analizy obejmą profile lotnych związków organicznych wytwarzanych przez różne szczepy bakterii w warunkach laboratoryjnych.

Uzyskane dane mają posłużyć do oceny, czy określone wzorce metabolomiczne mogą być powiązane z właściwościami szczepów, ich podatnością na bakteriofagi oraz zmianami zachodzącymi podczas oddziaływania fagów na populację bakteryjną.

Przewidziano również zastosowanie metod statystycznych i uczenia maszynowego w celu identyfikacji potencjalnych biomarkerów.

W jaki sposób analiza lotnych metabolitów może wspierać dobór bakteriofagów?

Lotne związki organiczne jako odzwierciedlenie metabolizmu bakterii

Lotne związki organiczne (ang. volatile organic compounds, VOC) stanowią zróżnicowaną grupę substancji chemicznych, które ze względu na swoje właściwości fizykochemiczne mogą przechodzić do fazy gazowej.

Drobnoustroje uwalniają takie związki jako produkty przemian metabolicznych. Ich skład jakościowy i ilościowy zależy między innymi od gatunku, szczepu, warunków wzrostu oraz aktualnego stanu fizjologicznego mikroorganizmu.

Analiza mieszaniny lotnych metabolitów określana jest jako profilowanie wolatilomu, czyli zbioru lotnych związków wytwarzanych przez badany organizm.

W przypadku P. aeruginosa profile te mogą odzwierciedlać zmiany metaboliczne towarzyszące adaptacji do przewlekłego zakażenia.

Badacze zakładają, że analiza takich profili może potencjalnie dostarczyć dodatkowych informacji o właściwościach izolatu, których nie da się bezpośrednio uzyskać na podstawie samej identyfikacji gatunku bakterii.

GC-QTOF-MS: rozdzielanie i identyfikacja związków chemicznych

W projekcie zaplanowano wykorzystanie chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrią mas z analizatorem kwadrupolowym i czasem przelotu jonów (ang. gas chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, GC-QTOF-MS).

Chromatografia gazowa umożliwia rozdzielenie składników mieszaniny substancji lotnych, natomiast spektrometria mas dostarcza danych pomocnych w ich identyfikacji na podstawie właściwości jonów i widm masowych.

Analizatory typu QTOF pozwalają uzyskiwać pomiary o wysokiej rozdzielczości masowej, co jest szczególnie istotne w przypadku złożonych mieszanin metabolitów.

Wyniki pomiarów mogą zostać przedstawione w postaci profili obejmujących obecność poszczególnych związków oraz ich względną intensywność.

Porównywanie takich profili między szczepami i warunkami eksperymentalnymi mogłoby ujawnić wzorce towarzyszące określonym właściwościom biologicznym bakterii.

Uczenie maszynowe w poszukiwaniu wzorców metabolomicznych

Analiza wielu równocześnie oznaczanych substancji wymaga metod umożliwiających identyfikowanie zależności wielowymiarowych.

Właśnie dlatego zespół zamierza wykorzystać narzędzia uczenia maszynowego. Ich zadaniem będzie poszukiwanie kombinacji sygnałów chemicznych, które mogłyby odróżniać izolaty o różnych właściwościach.

Z perspektywy przyszłego zastosowania klinicznego szczególnie interesujące byłoby znalezienie wzorca pozwalającego przewidzieć podatność bakterii na określone bakteriofagi, zanim zostaną zakończone wszystkie klasyczne testy mikrobiologiczne.

Jest to jednak hipoteza wymagająca weryfikacji. Samo wykrycie różnic pomiędzy profilami VOC nie oznacza jeszcze, że na ich podstawie można wiarygodnie przewidywać skuteczność fagoterapii.

Czy w przyszłości wystarczy analiza wydychanego powietrza?

Jednym z kierunków rozwoju diagnostyki opartej na VOC jest analiza składu wydychanego powietrza.

Metoda taka mogłaby ograniczać konieczność pobierania materiału z dolnych dróg oddechowych, szczególnie u osób, które nie odkrztuszają plwociny. Ma to znaczenie w kontekście zmieniającego się fenotypu mukowiscydozy u pacjentów skutecznie leczonych modulatorami CFTR.

Należy jednak odróżnić dwie sytuacje: laboratoryjne oznaczanie związków uwalnianych przez hodowlę bakteryjną oraz bezpośrednie badanie powietrza wydychanego przez pacjenta.

W pierwszym przypadku analizowany sygnał pochodzi z kontrolowanego układu eksperymentalnego. W drugim jest składnikiem znacznie bardziej złożonej mieszaniny obejmującej zarówno metabolity drobnoustrojów, jak i związki pochodzące od gospodarza oraz ze środowiska.

Dlatego wykrycie potencjalnego biomarkera w hodowli P. aeruginosa nie jest równoznaczne z potwierdzeniem jego przydatności w analizie oddechu.

Co wcześniejsze badania wykazały o metabolitach Pseudomonas aeruginosa?

Przesłanek uzasadniających badanie wolatilomu P. aeruginosa dostarcza między innymi praca opublikowana w 2020 roku w czasopiśmie mSphere przez Trentona J. Davisa, Avę V. Karanjię, Charity N. Bhebhe, Sarah B. West, Matthew Richardsona i Heather D. Bean.

Autorzy oceniali, czy profil lotnych metabolitów bakterii zmienia się podczas wieloletniego przewlekłego zakażenia płuc u osób z mukowiscydozą.

Wykorzystano 81 izolatów P. aeruginosa pochodzących od 17 pacjentów. Materiał obejmował izolaty uzyskiwane na różnych etapach przewlekłego zakażenia, z obserwacją obejmującą co najmniej pięć lat.

W odróżnieniu od nowego projektu niemiecko-holenderskiego badanie z 2020 roku nie miało na celu przewidywania podatności bakterii na bakteriofagi. Analizowano w nim przede wszystkim zmienność metabolomiczną podczas adaptacji drobnoustroju do środowiska przewlekłego zakażenia.

Duża zmienność profili lotnych metabolitów

Badacze zastosowali kompleksową dwuwymiarową chromatografię gazową połączoną ze spektrometrią mas z analizatorem czasu przelotu jonów (GC×GC-TOF-MS).

W analizowanym materiale wykryto 539 lotnych związków przypisywanych metabolizmowi badanych izolatów. Spośród nich 69 związków należało do względnie zachowanego rdzenia wolatilomu, obecnego w zdecydowanej większości próbek.

Stwierdzono znaczną heterogenność profili pomiędzy izolatami.

Co istotne, wraz z postępem przewlekłego zakażenia wolatilomy izolatów pochodzących od tej samej osoby mogły stawać się coraz bardziej odmienne. W niektórych przypadkach różnice wewnątrz populacji bakterii pochodzącej od jednego pacjenta były porównywalne z różnicami pomiędzy izolatami od różnych pacjentów.

Wyniki wskazały również, że w przebiegu przewlekłego zakażenia nie musi dochodzić do istotnego ograniczenia samej liczby lub różnorodności produkowanych substancji lotnych.

Zmieniają się natomiast względne ilości określonych związków, w tym niektórych węglowodorów, alkoholi i aldehydów. Zmiany te były powiązane z właściwościami fenotypowymi bakterii.

Dlaczego te obserwacje są istotne dla nowego projektu?

Badanie Davisa i współpracowników dostarczyło dowodów, że metabolizm lotnych związków organicznych zmienia się podczas przewlekłej adaptacji P. aeruginosa.

Wyniki uzasadniają dalsze poszukiwanie biomarkerów metabolomicznych, ale jednocześnie pokazują, jak złożone może być opracowanie uniwersalnego testu diagnostycznego.

Jeżeli profile VOC wykazują dużą zmienność zarówno pomiędzy pacjentami, jak i w obrębie szczepów pochodzących od tej samej osoby, algorytm diagnostyczny musi uwzględniać tę heterogenność.

Nie wystarczy zatem wskazanie pojedynczego metabolitu, którego stężenie wzrasta lub maleje. Potencjalnie bardziej przydatna może okazać się analiza kombinacji wielu związków i ich wzajemnych proporcji.

W badaniu z 2020 roku nie wykazano jednak, aby określony profil VOC przewidywał wrażliwość P. aeruginosa na bakteriofagi. To właśnie jedna z kwestii, które nowy projekt ma dopiero zbadać.

Jakie są obecne dowody kliniczne dotyczące fagoterapii w mukowiscydozie?

Personalizowana fagoterapia wziewna w badaniu opublikowanym w Nature Medicine

W kwietniu 2025 roku w czasopiśmie Nature Medicine opublikowano pracę zespołu Benjamina K. Chana, Gail L. Stanley, Kaitlyn E. Kortright i współpracowników dotyczącą personalizowanej terapii bakteriofagowej u dorosłych z mukowiscydozą.

Autorzy przedstawili doświadczenia z leczenia dziewięciu osób, u których stwierdzano zakażenia wielolekoopornymi lub opornymi na praktycznie wszystkie badane antybiotyki szczepami P. aeruginosa, trudne do opanowania wcześniejszym leczeniem przeciwbakteryjnym.

Pacjenci otrzymywali bakteriofagi w nebulizacji, w postaci pojedynczego faga albo mieszaniny fagów, w ramach indywidualnego zastosowania terapeutycznego.

Istotną cechą strategii był wybór fagów nie tylko ze względu na zdolność niszczenia bakterii, ale również ze względu na przewidywane konsekwencje ewolucyjnego nabywania oporności na fagi.

Zakładano, że bakterie, które rozwiną oporność na wybrane fagi, mogą równocześnie utracić część właściwości odpowiedzialnych za oporność na antybiotyki albo wirulencję.

W analizowanej grupie odnotowano zmniejszenie obciążenia P. aeruginosa w plwocinie. Mediana spadku liczby bakterii wyniosła 10⁴ CFU/ml w okresie od 5 do 18 dni po terapii.

Autorzy opisali również poprawę FEV₁ wyrażonej jako odsetek wartości należnej. Mediana poprawy wyniosła 6 punktów procentowych w obserwacji prowadzonej od 21 do 35 dni po leczeniu.

W przedstawionej grupie nie zgłoszono zdarzeń niepożądanych związanych z podaniem fagów.

Należy jednak podkreślić, że była to niewielka seria indywidualnych zastosowań terapeutycznych bez randomizowanej grupy kontrolnej. Wyniki nie pozwalają na jednoznaczne przypisanie wszystkich obserwowanych zmian samej fagoterapii ani na określenie jej skuteczności w szerszej populacji chorych.

Randomizowane badanie preparatu BX004-A

Kolejnych danych dostarczyła publikacja w Nature Communications z lipca 2025 roku, dotycząca wziewnego preparatu BX004-A.

Preparat stanowi mieszaninę trzech bakteriofagów ukierunkowanych na P. aeruginosa.

W części pierwszej badania fazy 1b/2a, przeprowadzonego metodą podwójnie ślepej próby z randomizacją i kontrolą placebo, uczestniczyło dziewięciu dorosłych pacjentów z mukowiscydozą oraz przewlekłym zakażeniem P. aeruginosa.

Badanie osiągnęło pierwszorzędowe cele dotyczące bezpieczeństwa i tolerancji preparatu.

Potwierdzono możliwość dostarczania bakteriofagów do dolnych dróg oddechowych. W grupie otrzymującej preparat zaobserwowano także sygnał potencjalnego zmniejszenia obciążenia bakteryjnego w plwocinie.

Autorzy zaznaczyli jednak, że mała liczebność badanej populacji ogranicza możliwość formułowania definitywnych wniosków dotyczących skuteczności klinicznej.

Nie są to zatem wyniki potwierdzające, że terapia BX004-A zapobiega zaostrzeniom choroby płuc, ogranicza hospitalizacje albo spowalnia długoterminowe pogarszanie czynności płuc.

Znaczenie doboru fagów do konkretnego izolatu

Obie publikacje wskazują na znaczenie właściwości biologicznych bakteriofagów oraz drobnoustrojów, przeciwko którym są stosowane.

W przypadku personalizowanej fagoterapii jednym z podstawowych warunków jest potwierdzenie podatności izolatu bakteryjnego na planowany preparat.

W tym kontekście rozwijana we Frankfurcie i Wageningen diagnostyka metabolomiczna mogłaby w przyszłości stanowić narzędzie wspomagające klasyczne testowanie podatności.

Nie wiadomo jednak, czy analiza VOC okaże się wystarczająco swoista i powtarzalna, aby rzeczywiście skrócić czas wyboru fagów, a tym bardziej zastąpić bezpośrednie testy mikrobiologiczne.

Ograniczenia projektu i perspektywy wykorzystania metody w praktyce klinicznej

Jakie wymagania musi spełnić przyszły test diagnostyczny?

Przejście od laboratoryjnej identyfikacji profili VOC do zastosowania klinicznego wymaga rozwiązania kilku odrębnych problemów.

Po pierwsze, konieczne jest wykazanie, że obserwowane różnice metabolomiczne są rzeczywiście powiązane z podatnością bakterii na określone bakteriofagi, a nie jedynie z innymi właściwościami szczepu lub warunkami prowadzenia hodowli.

Po drugie, niezbędna będzie walidacja uzyskanych wzorców na niezależnych kolekcjach izolatów. Dotyczy to szczególnie modeli wykorzystujących uczenie maszynowe, ponieważ wysoka dokładność klasyfikacji w zbiorze użytym do opracowania algorytmu nie gwarantuje porównywalnej skuteczności w innych laboratoriach.

Po trzecie, ewentualna przydatność kliniczna będzie zależała od porównania nowej metody z istniejącymi standardami mikrobiologicznymi. Istotne będą między innymi czułość i swoistość, powtarzalność pomiarów, czas uzyskiwania wyniku oraz zdolność przewidywania rzeczywistej podatności bakterii na fagi.

Osobnym zagadnieniem pozostaje możliwość wykorzystania takich biomarkerów do monitorowania odpowiedzi na fagoterapię. Zmiana profilu lotnych metabolitów może odzwierciedlać modyfikację aktywności metabolicznej bakterii, jednak nie musi oznaczać ich eliminacji ani poprawy stanu klinicznego pacjenta.

Oporność na bakteriofagi jako dodatkowe wyzwanie

Podobnie jak w przypadku antybiotyków, bakterie mogą wykształcać mechanizmy ograniczające skuteczność bakteriofagów.

Oporność może pojawiać się wskutek zmian receptorów powierzchniowych wykorzystywanych przez fagi, aktywacji bakteryjnych mechanizmów obronnych lub selekcji istniejących wcześniej subpopulacji.

W niektórych sytuacjach ewolucyjna adaptacja bakterii do obecności fagów może wiązać się ze zmniejszeniem ich wirulencji lub wrażliwością na określone antybiotyki. Nie jest to jednak reguła obowiązująca dla każdej kombinacji fag-bakteria.

Możliwość monitorowania zmian metabolicznych podczas takiej adaptacji stanowi jeden z interesujących kierunków badań.

Nowe rekomendacje dotyczące personalizowanej fagoterapii

Ważnym kontekstem dla rozwoju omawianych metod jest opublikowany 21 września 2026 roku w Nature Medicine dokument konsensusowy „A consensus-based guideline for personalized bacteriophage therapy”.

Wśród autorów znaleźli się między innymi Silvia Würstle, Simone C. Lieberknecht-Jouy, Anja Düchting, Holger Lößner, Pieter-Jan Ceyssens i Jean-Paul Pirnay.

Dokument opracowano w ramach prac prowadzonych z udziałem licznych towarzystw naukowych, ekspertów międzynarodowych oraz przedstawicieli środowiska pacjentów.

Przedstawiono w nim ponad 60 rekomendacji i stanowisk dotyczących zasad personalizowanej fagoterapii, infrastruktury laboratoryjnej, doboru i przygotowania preparatów, kontroli jakości, podawania fagów oraz monitorowania leczenia.

Autorzy podkreślają znaczenie potwierdzania podatności bakterii na wybrane fagi możliwie blisko momentu rozpoczęcia leczenia, ponieważ wrażliwość drobnoustrojów może zmieniać się w czasie.

W dokumencie zwrócono również uwagę na potrzebę standaryzacji badań laboratoryjnych oraz dokumentowania odpowiedzi mikrobiologicznej i klinicznej.

Opracowanie takich standardów ma znaczenie dla dalszego rozwoju fagoterapii, ale nie oznacza automatycznego włączenia jej do rutynowych schematów leczenia przewlekłych zakażeń P. aeruginosa w mukowiscydozie.

Co może zmienić projekt niemiecko-holenderski?

Najważniejszą potencjalną korzyścią byłoby opracowanie narzędzia, które pozwalałoby szybciej identyfikować izolaty bakteryjne o określonych właściwościach i wspomagać wybór fagów do dalszego testowania.

Drugim możliwym zastosowaniem jest poszukiwanie wskaźników odzwierciedlających zmiany zachodzące w populacji bakterii podczas terapii, w tym rozwój oporności na bakteriofagi.

W dalszej perspektywie interesującym kierunkiem pozostaje przeniesienie analizy lotnych metabolitów z warunków laboratoryjnych do metod mniej obciążających pacjenta, w tym diagnostyki opartej na wydychanym powietrzu.

Każde z tych zastosowań wymaga jednak oddzielnej walidacji. Obecny projekt nie dostarcza jeszcze danych pozwalających ocenić jego skuteczność diagnostyczną lub wpływ na wyniki leczenia.

Podsumowując, projekt kierowany przez dr. Olafa Tyca dotyczy jednego z podstawowych problemów ograniczających rozwój personalizowanej fagoterapii: szybkiego i wiarygodnego doboru bakteriofagów do biologicznie zróżnicowanych izolatów bakterii. Dotychczasowe badania wskazują, że wolatilom P. aeruginosa odzwierciedla część zmian zachodzących podczas przewlekłego zakażenia, a wczesne doświadczenia kliniczne uzasadniają dalszą ocenę bakteriofagów w leczeniu wybranych zakażeń u osób z mukowiscydozą. Nie wiadomo jednak, czy połączenie tych dwóch obszarów badawczych umożliwi opracowanie wiarygodnego testu wspomagającego dobór i monitorowanie fagoterapii. Rozstrzygnięcie tego zagadnienia będzie wymagało kolejnych badań laboratoryjnych, niezależnej walidacji diagnostycznej i ostatecznie oceny klinicznej.