Unerwienie trzustki w mukowiscydozie: utrata i przebudowa włókien nerwowych wiązały się z zaburzeniami wydzielania hormonów

Mukowiscydoza może wpływać nie tylko na zewnątrzwydzielniczą i hormonalną funkcję trzustki, ale również na jej unerwienie. Xingshen Sun, Yaling Yi i współautorzy przeanalizowali próbki ludzkiej trzustki, odpowiedź hormonalną u małych dzieci z mukowiscydozą oraz kilka eksperymentalnych modeli choroby u fretek. W trzustkach osób z mukowiscydozą stwierdzili znaczne ograniczenie barwienia markerów neuronalnych, szczególnie struktur związanych z unerwieniem przywspółczulnym, a u dzieci z mukowiscydozą obserwowali zaburzoną odpowiedź polipeptydu trzustkowego na doustne obciążenie glukozą.

W modelu fretki zmiany unerwienia rozwijały się po urodzeniu wraz z postępem choroby trzustki. Co istotne, eksperymentalne opóźnienie rozwoju choroby zewnątrzwydzielniczej trzustki za pomocą modulatora CFTR VX-770 u fretek z wariantem G551D wiązało się z zachowaniem markerów neuronalnych oraz przywróceniem odpowiedzi wydzielniczej polipeptydu trzustkowego na glukozę. Autorzy interpretują wyniki jako przesłankę, że wczesna utrata i przebudowa unerwienia trzustki może uczestniczyć w zaburzeniach wydzielania hormonów wysp trzustkowych w mukowiscydozie.

Autorzy, ośrodki i publikacja

Autorami publikacji są Xingshen Sun, Yaling Yi, Shanming Hu, Gulnara Novbatova, Aliye Uc, Katie Larson Ode, John F Engelhardt oraz Andrew W Norris. Xingshen Sun i Yaling Yi zostali wskazani jako współautorzy pierwszego autorstwa, z równym wkładem w ogólny rozwój projektu i przygotowanie manuskryptu. Autorem korespondencyjnym jest Andrew W Norris.

Autorzy byli afiliowani przy następujących jednostkach:

• Pulmonary, Allergy, and Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama, USA;
• Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, Iowa City, Iowa, USA;
• Fraternal Order of Eagle Diabetes Research Center, University of Iowa, Iowa City, Iowa, USA;
• Department of Radiation Oncology, University of Iowa, Iowa City, Iowa, USA.

Dlaczego badacze zainteresowali się unerwieniem trzustki?

Autorzy wyszli od obserwacji, że autonomiczny układ nerwowy modyfikuje wydzielanie kilku hormonów wysp trzustkowych, w tym insuliny, glukagonu i polipeptydu trzustkowego (PP; ang. pancreatic polypeptide). Szczególną pozycję zajmuje PP, ponieważ jego fizjologiczne wydzielanie jest w bardzo dużym stopniu zależne od unerwienia przywspółczulnego.

W mukowiscydozie zaburzone jest fizjologiczne wydzielanie wszystkich trzech wymienionych hormonów. Autorzy zwracają uwagę, że niedostateczne wydzielanie insuliny, zwłaszcza jej wczesnej fazy, odgrywa zasadniczą rolę w nieprawidłowościach glikemicznych i cukrzycy związanej z mukowiscydozą (CFRD; ang. cystic fibrosis-related diabetes). Zaburzeniu może również ulegać odpowiedź glukagonowa na hipoglikemię. Najbardziej nasilone nieprawidłowości dotyczą jednak PP – w mukowiscydozie odpowiedź tego hormonu na bodźce fizjologiczne może być niemal całkowicie zniesiona.

Jednocześnie wyspy trzustkowe pozostają względnie zachowane w porównaniu z rozległym uszkodzeniem części zewnątrzwydzielniczej trzustki. Zdaniem autorów wskazuje to, że zaburzeń funkcji hormonalnej nie można tłumaczyć wyłącznie utratą masy komórek wyspowych.

Celem pracy była odpowiedź na pytanie, czy unerwienie autonomiczne trzustki jest zaburzone w mukowiscydozie i czy takie zmiany mogą być związane z nieprawidłowym wydzielaniem hormonów wysp trzustkowych.

Jak przeprowadzono badanie?

Projekt obejmował kilka wzajemnie uzupełniających się części: badania fizjologiczne u małych dzieci, analizę ludzkich próbek trzustki, doświadczenia na modelu fretki z mukowiscydozą, badania izolowanych wysp trzustkowych oraz eksperyment, w którym za pomocą modulatora CFTR opóźniano rozwój choroby trzustki u fretek.

Badania u dzieci z mukowiscydozą

Do części klinicznej prospektywnie rekrutowano dzieci w wieku od 3 miesięcy do 6 lat w University of Iowa oraz University of Minnesota. Badaniem objęto zarówno dzieci z mukowiscydozą, jak i osoby kontrolne bez CF.

Uczestnicy przechodzili często próbkowany doustny test tolerancji glukozy (OGTT; ang. oral glucose tolerance test). Dawka glukozy wynosiła 1,75 g/kg masy ciała, maksymalnie 75 g. Łącznie przeprowadzono 62 testy OGTT u 38 uczestników. Część dzieci poddawano badaniu więcej niż jeden raz. Sześć testów nie obejmowało próbek ze wszystkich punktów czasowych i nie zostało uwzględnionych w analizie pola pod krzywą, natomiast dostępne dane włączono do modelowania efektów mieszanych uwzględniającego powtarzane pomiary u tych samych uczestników.

W głównej analizie odpowiedzi PP przedstawionej na rycinie 3 znalazło się 22 dzieci z mukowiscydozą i 10 osób kontrolnych. Dzieci z wariantami CFTR, o których wiadomo, że zachowują funkcję resztkową białka, analizowano oddzielnie.

Ocena ludzkiej trzustki

Utrwalone próbki ludzkiej trzustki pozyskano z National Disease Research Interchange (NDRI), a bloczki parafinowe przygotowano w University of Iowa Comparative Pathology Laboratory. Autorzy przeprowadzili immunomikroskopową ocenę markerów neuronalnych oraz komórek produkujących hormony wysp trzustkowych.

Do oceny ogólnego unerwienia wykorzystano neuronoswoistą beta-tubulinę klasy III, oznaczaną przeciwciałem TUJ1. Unerwienie przywspółczulne oceniano za pomocą pęcherzykowego transportera acetylocholiny (VAChT; ang. vesicular acetylcholine transporter), natomiast struktury układu współczulnego oceniano przy użyciu hydroksylazy tyrozynowej (TH; ang. tyrosine hydroxylase).

Model fretki z mukowiscydozą

W podstawowym modelu choroby wykorzystywano fretki homozygotyczne pod względem przerwania genu CFTR w eksonie 10. Zwierzęta z CF od urodzenia hodowano razem z kontrolnym rodzeństwem typu dzikiego i zapewniano im identyczną opiekę, obejmującą również konieczne dla tego modelu wsparcie antybiotykowe i żywieniowe.

Autorzy wyróżniali kolejne fazy zmian trzustkowych u fretek z CF: fazę I przed kryzysem w wieku 5-15 dni, fazę II obejmującą kryzys trzustkowy w wieku 26-60 dni, fazę III po kryzysie w wieku 75-110 dni oraz fazę IV, związaną z ryzykiem hiperglikemii, od około 130. dnia życia.

U fretek wykonywano OGTT po czterogodzinnym poście, test tolerancji mieszanego posiłku oraz klamrę przechodzącą od hiperglikemii do hipoglikemii. W eksperymencie z klamrą początkowo wlewano dekstrozę w celu uzyskania glikemii około 240 mg/dl, a po 60 minutach rozpoczynano podawanie insuliny lispro i dążono do glikemii około 45 mg/dl. W trakcie doświadczenia oznaczano między innymi PP i glukagon.

Izolowane wyspy trzustkowe

Wyspy izolowano z trzustek nowo narodzonych fretek i dojrzewano w hodowli przez 9 dni. Następnie przeprowadzano perifuzję w zamkniętej komorze. Po okresie równoważenia wyspy stymulowano roztworem zawierającym 10 mmol/l argininy, a po doświadczeniu oznaczano zawartość PP w wyspach.

Eksperymentalne opóźnienie choroby trzustki

Oddzielny model obejmował fretki homozygotyczne pod względem wariantu CFTR G551D. Autorzy zastosowali VX-770, czyli ivacaftor, aby opóźnić wystąpienie jawnej choroby związanej z CF. Ciężarne samice otrzymywały 20 mg/kg VX-770 dwa razy dziennie od 28. dnia ciąży do 23. dnia po porodzie. Następnie lek podawano bezpośrednio młodym w dawce 10 mg/kg dwa razy dziennie do 30. dnia życia. Zwierzęta hodowane w ten sposób autorzy określili jako CF_delay.

Trzustki części tych zwierząt analizowano w wieku 75 dni. W osobnym doświadczeniu funkcjonalnym oceniano 9-miesięczne fretki CF_delay, u których VX-770 odstawiono w wieku 4 miesięcy, i porównywano ich odpowiedź PP podczas OGTT z odpowiedzią zwierząt kontrolnych.

Mikroskopia i analiza statystyczna

Obrazy uzyskiwano przy użyciu mikroskopii konfokalnej Zeiss LSM 710. Personel wykonujący obrazowanie pozostawał zaślepiony względem hipotez badania. Pliki analizowano w Fiji:ImageJ, bez nieliniowego przetwarzania obrazu. Gęstość struktur neuronalnych wyrażano jako powierzchnię zajmowaną przez markery neuronalne odniesioną do powierzchni trzustki.

Analizy statystyczne wykonano w programie R w wersji 4.5.0. Stosowano między innymi test sumy rang Wilcoxona oraz modele efektów mieszanych z pakietem lme4. W odpowiednich analizach post hoc wykorzystywano pakiet emmeans, metodę Kenwarda-Rogera do oceny stopni swobody oraz korektę Tukeya dla wielokrotnych porównań. Za próg istotności statystycznej przyjęto p<0,05.

Mukowiscydoza wiązała się ze zmianami unerwienia trzustki

Znacznie mniej struktur TUJ1 w ludzkiej trzustce z CF

W trzustkach osób kontrolnych autorzy obserwowali liczne aksony TUJ1-dodatnie przechodzące przez część pozaendokrynną narządu i kontaktujące się z wyspami. W próbkach trzustki osób z mukowiscydozą struktur TUJ1-dodatnich było niewiele, a niemal żadna z nich nie miała morfologii jednoznacznie odpowiadającej neuronowi lub aksonowi.

U fretek obraz był bardziej złożony. W trzustkach zwierząt typu dzikiego widoczne były zarówno aksony w miąższu pozaendokrynnym, jak i sieci wypustek TUJ1-dodatnich wewnątrz wysp. W wyspach fretek z CF również stwierdzano struktury przypominające aksony, ale ich morfologia i rozmieszczenie różniły się od kontroli. Wiele wypustek było grubszych niż w wyspach zwierząt typu dzikiego.

Istotna była również dynamika zmian. U nowo narodzonych fretek zarówno z CF, jak i bez CF występowały liczne ciała komórkowe i aksony TUJ1-dodatnie. Wyraźne nieprawidłowości obserwowano dopiero później, po rozwoju choroby zewnątrzwydzielniczej trzustki.

Unerwienie przywspółczulne było szczególnie silnie zaburzone

VAChT jest markerem neuronalnym związanym z unerwieniem cholinergicznym i w pracy został wykorzystany do oceny struktur przywspółczulnych. W trzustce osób kontrolnych aksony VAChT-dodatnie były rozproszone w części pozaendokrynnej, również w pobliżu wysp.

W ludzkich próbkach trzustki z mukowiscydozą autorzy znajdowali natomiast niewiele takich struktur lub nie znajdowali ich wcale. W materiale uzupełniającym przedstawiono obrazy z czterech trzustek osób z CF i czterech trzustek kontrolnych. W jednej z trzustek z CF zidentyfikowano sporadyczne neurony lub aksony VAChT-dodatnie.

Podobny wzorzec stwierdzono u fretek w fazie III choroby. W trzustkach zwierząt typu dzikiego obecne były rozproszone aksony VAChT-dodatnie, niekiedy zlokalizowane blisko wysp, natomiast w trzustkach z CF struktury takie występowały bardzo rzadko.

Co ciekawe, w trzustkach nowo narodzonych fretek z CF ekspresja VAChT była nawet większa niż u zwierząt typu dzikiego i obejmowała liczne struktury wielkości komórek. W dyskusji autorzy zwracają uwagę, że nieprawidłowa organizacja tego markera jest widoczna jeszcze przed rozwinięciem jawnej choroby zewnątrzwydzielniczej.

Odpowiedź polipeptydu trzustkowego była osłabiona już u małych dzieci

Podczas OGTT dzieci z mukowiscydozą miały istotnie niższe stężenia PP niż osoby kontrolne. Różnica dotyczyła również przyrostowego pola pod krzywą w pierwszych 30 minutach testu (iAUC₃₀), dla którego w głównej analizie uzyskano p=0,004.

Co więcej, istotny wzrost PP względem wartości wyjściowej podczas doustnego obciążenia glukozą występował w grupie kontrolnej, ale nie u dzieci z mukowiscydozą. W modelu efektów mieszanych płeć nie wpływała istotnie na stężenie PP ani na interakcję pomiędzy płcią a grupą.

Autorzy pokazali oddzielnie dzieci z wariantami CFTR o zachowanej funkcji resztkowej. Ich wartości PP były bardziej zbliżone do kontroli niż do wyników dzieci z wariantami bez zachowanej funkcji resztkowej.

Podobną odpowiedź obserwowano u młodych fretek z CF

Młode fretki z mukowiscydozą również wykazywały słabszą odpowiedź PP na glukozę i mniejsze iAUC₃₀ niż zwierzęta kontrolne. Dla porównania iAUC₃₀ na rycinie 3 autorzy podali p=0,0006.

Wynik zależał jednak od zastosowanego bodźca. Po mieszanym posiłku wzrost PP u fretek z CF nie różnił się od obserwowanego w grupie kontrolnej.

Jeszcze innego bodźca dostarczył eksperyment z klamrą hiperglikemiczno-hipoglikemiczną. Podczas całego doświadczenia fretki z CF miały niższe stężenia PP niż zwierzęta kontrolne, z globalnym p=1,1 × 10^-10. Także wydzielanie glukagonu było istotnie mniejsze w grupie CF, z p=3,4 × 10^-8.

Niskiego PP nie wyjaśniał brak komórek produkujących ten hormon

Badacze sprawdzili, czy zaburzone wydzielanie PP może być prostą konsekwencją braku odpowiednich komórek. Wyniki nie potwierdziły takiego wyjaśnienia. W ludzkiej trzustce z mukowiscydozą, również w próbkach osób z CFRD, komórki produkujące PP wydawały się liczniejsze niż w materiale kontrolnym. Podobny wzorzec obserwowano w trzustkach fretek z CF.

Dodatkowych informacji dostarczyły izolowane wyspy trzustkowe fretek. Arginina szybko stymulowała wydzielanie PP zarówno z wysp kontrolnych, jak i z wysp zwierząt z CF. Gdy wydzielanie analizowano jako stężenie bezwzględne lub odsetek całkowitej zawartości PP w wyspie, nie stwierdzono różnicy między CF i kontrolą. Różnicę obserwowano natomiast przy wyrażaniu odpowiedzi jako krotności zmiany względem wartości wyjściowej.

Autorzy przeanalizowali także wpływ jednej odstającej preparacji kontrolnej, która wydzielała około rząd wielkości więcej PP niż pozostałe. Po jej uwzględnieniu bezwzględne oraz procentowe wydzielanie PP nadal nie różniło się globalnie między grupami. Zawartość PP w wyspach również nie różniła się istotnie: 6924 ± 2202 pg na ekwiwalent wyspy w kontroli wobec 5943 ± 734 pg w CF, p=0,73.

Zdaniem autorów połączenie obecności licznych komórek PP z zachowaną zdolnością izolowanych wysp do wydzielania hormonu przemawia przeciwko tezie, że bardzo niska fizjologiczna odpowiedź PP w mukowiscydozie wynika wyłącznie z pierwotnego defektu samych komórek produkujących ten hormon.

Nieprawidłowości dotyczyły również markerów układu współczulnego

Do oceny struktur współczulnych wykorzystano hydroksylazę tyrozynową. W ludzkiej trzustce kontrolnej autorzy obserwowali pojedyncze TH-dodatnie wypustki aksonalne przechodzące przez miąższ w pobliżu wysp. W materiale ludzkim z CF struktur takich było bardzo mało. Autorzy podkreślają jednak, że w tej części analizy dysponowali tylko jedną ludzką trzustką z CF, dlatego uznali wyciąganie dalej idących wniosków za przedwczesne.

U fretek różnice były wyraźniejsze. W wyspach zwierząt typu dzikiego występowała rozbudowana sieć TH-dodatnich wypustek aksonalnych. W trzustce z CF aksonów takich było niewiele lub nie obserwowano ich wcale, natomiast hydroksylaza tyrozynowa pojawiała się w licznych ciałach komórek wyspowych dodatnich również dla insuliny.

Odsetek komórek insulinododatnich wykazujących ekspresję hydroksylazy tyrozynowej wynosił 37 ± 3% w CF wobec 5 ± 2% w kontroli, p=0,0008. Nie stwierdzono analogicznego współwystępowania TH z glukagonem, PP lub somatostatyną.

Opóźnienie choroby trzustki zachowało markery neuronalne w modelu fretki

Jednym z najważniejszych elementów pracy był eksperyment pozwalający oddzielić obecność defektu CFTR od momentu pojawienia się ciężkiej choroby trzustki. Autorzy wykorzystali fretki z wariantem CFTR G551D, którego funkcję można przywracać za pomocą VX-770.

W grupie CF_delay ekspozycja na VX-770 opóźniała wystąpienie jawnej choroby CF trzustki. Gdy trzustki badano w wieku 75 dni po odstawieniu modulatora w 30. dniu życia, autorzy obserwowali liczne struktury neuronalne TUJ1-dodatnie. Gęstość barwienia TUJ1 była nawet większa niż u zwierząt typu dzikiego: powierzchnia TUJ1-dodatnia wynosiła 17,2% z zakresem błędu standardowego 11,3-26,3% w CF_delay wobec 3,3% z zakresem 1,7-6,5% u WT, p<0,05.

Struktury VAChT-dodatnie były ponadto rozproszone w trzustkach zarówno zwierząt typu dzikiego, jak i CF_delay. Autorzy ocenili następnie konsekwencje funkcjonalne opóźnienia choroby. U 9-miesięcznych fretek CF_delay, u których VX-770 odstawiono w wieku 4 miesięcy, odpowiedź PP na doustną glukozę nie różniła się od odpowiedzi zwierząt kontrolnych. Szczyt stężenia PP po 30 minutach był niemal identyczny, a różnica iAUC₆₀ nie była istotna statystycznie, p=0,48.

Autorzy wskazują również na alternatywne wyjaśnienie wyjątkowo dużej gęstości struktur TUJ1-dodatnich w trzustkach CF_delay. Po późniejszym rozwoju choroby i utracie komórek pęcherzykowych ta sama liczba włókien nerwowych mogła zostać skupiona w znacznie mniejszej objętości tkanki. Drugą możliwością jest nadmierne powstawanie aksonów i nerwów. Dostępne dane nie pozwalały badaczom odróżnić tych mechanizmów.

Jak autorzy interpretują znaczenie wyników?

Według autorów uzyskane dane wskazują, że trzustka w mukowiscydozie ulega wyraźnej utracie oraz przebudowie unerwienia. Szczególnie spójne wyniki uzyskano dla markerów układu przywspółczulnego. Zarówno w ludzkiej trzustce z CF, jak i w trzustkach fretek po rozwinięciu choroby zewnątrzwydzielniczej struktury VAChT-dodatnie były bardzo nieliczne.

Jednocześnie u bardzo małych dzieci z mukowiscydozą stwierdzono już znaczne zaburzenie odpowiedzi PP na doustną glukozę. Dzięki badaniu dzieci w tym wieku autorzy ograniczyli możliwość, że obserwowane zaburzenie jest wtórnym następstwem neuropatii związanej z wieloletnią hiperglikemią.

Istotnym elementem interpretacji jest zestawienie kilku obserwacji: komórki produkujące PP pozostawały obecne, a nawet wydawały się liczniejsze w trzustkach z CF; izolowane wyspy fretek z CF zachowywały zdolność wydzielania PP po stymulacji argininą; równocześnie fizjologiczna odpowiedź PP na doustną glukozę była głęboko zaburzona, a markery unerwienia przywspółczulnego niemal zanikały.

Konsekwencje takiego mechanizmu mogą wykraczać poza wydzielanie PP. Autorzy wskazują, że unerwienie przywspółczulne zwiększa wczesną fazę wydzielania insuliny, natomiast układ współczulny i prawdopodobnie również przywspółczulny uczestniczą w odpowiedzi glukagonowej na hipoglikemię. Utrata lub nieprawidłowa przebudowa tych szlaków może więc potencjalnie współuczestniczyć w szerszym zaburzeniu czynności endokrynnej trzustki w CF.

Autorzy rozważają kilka możliwych mechanizmów powstawania uszkodzenia neuronalnego. Wymieniają między innymi wtórne uszkodzenie włókien nerwowych podczas zapalenia i destrukcji części zewnątrzwydzielniczej, mechanizmy związane z CFTR w komórkach Schwanna oraz utratę funkcji CFTR w samych neuronach. Przeprowadzone badanie nie pozwala jednak rozstrzygnąć, który z tych mechanizmów odpowiada za obserwowane zmiany.

Praca wskazuje ponadto, że wczesny okres życia może być szczególnym okresem podatności unerwienia trzustki na trwałe uszkodzenie. W modelu fretki utrata ogólnego unerwienia następowała w pierwszych dwóch miesiącach życia, pomiędzy okresem noworodkowym a fazą III zmian trzustkowych. Opóźnienie ciężkiej choroby zewnątrzwydzielniczej poza pierwszy miesiąc życia pozwalało zachować znaczną część struktur neuronalnych.

W dyskusji autorzy przedstawiają również możliwość, że ograniczenie unerwienia może częściowo pomagać wyjaśnić, dlaczego osoby z mukowiscydozą zazwyczaj odczuwają stosunkowo niewielki ból trzustki pomimo rozległej choroby zewnątrzwydzielniczej. Jest to jednak interpretacja mechanistyczna przedstawiona przez autorów, a nie osobny punkt końcowy badania.

Hydroksylaza tyrozynowa w komórkach beta

Osobnym spostrzeżeniem była nasilona ekspresja hydroksylazy tyrozynowej w komórkach beta fretek z CF. Autorzy omawiają możliwość, że może ona stanowić dodatkowy mechanizm ograniczający wydzielanie insuliny w tym modelu. W badanej ludzkiej trzustce z CF nie zaobserwowano jednak analogicznej ekspresji TH w komórkach insulinododatnich, dlatego obserwacji z fretki nie można automatycznie przenosić na człowieka.

Ograniczenia badania

Za mocną stronę pracy autorzy uznają równoległe wykorzystanie próbek ludzkich i modelu fretki oraz możliwość porównania zmian strukturalnych z zaburzeniami wydzielania hormonów. Podkreślają jednak, że podobieństwa pomiędzy gatunkami nie eliminują istotnych różnic w organizacji unerwienia trzustki.

Finansowanie i konflikty interesów

Granty NIH R01-DK115791 i RC2-DK124207 wskazano jako wsparcie dla John F Engelhardt i Andrew W Norris, grant Cystic Fibrosis Foundation SUN22G0-CFRD dla Xingshen Sun, a Faculty Scholar Award from the F.O.E. Diabetes Research Center dla Andrew W Norris.