NUPR1 chroni mitochondria i hamuje ferroptozę w nabłonku płuc. Nowy mechanizm związany z patogenezą POChP

Utrata białka odpowiedzi na stres NUPR1 może zwiększać podatność komórek nabłonka płuc na ferroptozę, nasilać stres oksydacyjny, zaburzać funkcjonowanie mitochondriów i prowadzić do głębokiego przeprogramowania metabolizmu komórkowego. Badacze z Yale School of Medicine i kilku współpracujących ośrodków wykazali ponadto, że myszy pozbawione Nupr1 wykazują nieprawidłowości mitochondrialne, większe uszkodzenia oksydacyjne, a po przewlekłej ekspozycji na dym tytoniowy również powiększenie przestrzeni powietrznych odpowiadające zmianom rozedmowym. Wyniki wskazują, że NUPR1 może być jednym z elementów łączących stres oksydacyjny, metabolizm żelaza, mitochondria i ferroptozę w patogenezie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc.

NUPR1, ferroptoza i POChP

Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP, ang. chronic obstructive pulmonary disease, COPD) jest związana z przewlekłym uszkodzeniem nabłonka oddechowego, stanem zapalnym, stresem oksydacyjnym i postępującą destrukcją miąższu płuc. Jedną z patologicznych manifestacji choroby jest rozedma, w której dochodzi do utraty struktury ścian pęcherzyków płucnych i powiększania przestrzeni powietrznych.

W ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się nie tylko klasycznej apoptozie, ale również innym regulowanym mechanizmom śmierci komórkowej. Jednym z nich jest ferroptoza – forma śmierci komórki zależna od żelaza i związana z niekontrolowaną peroksydacją lipidów błonowych.

W warunkach nadmiernego stresu oksydacyjnego jony żelaza Fe²⁺ mogą uczestniczyć w reakcjach prowadzących do powstawania bardzo reaktywnych rodników. Jeżeli jednocześnie zawodzi komórkowa ochrona antyoksydacyjna, dochodzi do narastającego utleniania lipidów błonowych. Kluczową linię obrony stanowią między innymi glutation oraz peroksydaza glutationowa 4 (GPX4). Istotną rolę odgrywa również antyporter cystyna/glutaminian systemu X_c^–, którego składnikiem jest SLC7A11.

Nuclear protein 1 (NUPR1) jest białkiem indukowanym przez stres komórkowy, mogącym przemieszczać się do jądra i współuczestniczyć w regulacji transkrypcji poprzez interakcje z innymi białkami wiążącymi DNA i kompleksami regulatorowymi. Wcześniejsze badania wiązały NUPR1 z odpowiedzią na stres, metabolizmem żelaza, biologią mitochondriów oraz ferroptozą.

Grupa Maora Saulera wcześniej wykazała, że w komórkach pęcherzykowych typu 2 (AT2) pochodzących od osób z rozedmą ekspresja NUPR1 jest wyraźnie obniżona. Wykazano także, że zahamowanie NUPR1 zwiększa podatność komórek na zależną od żelaza śmierć po ekspozycji na ekstrakt dymu papierosowego. Nowa praca miała odpowiedzieć na pytanie, jakie mechanizmy komórkowe mogą odpowiadać za to zjawisko.

Autorzy i ośrodki badawcze

Autorami pracy zatytułowanej The ferroptosis inhibitor NUPR1 coordinates the mitochondrial response to oxidative stress and cell metabolism during COPD pathogenesis in the lung są Jessica Nouws, Saul S. Siller, Tao Yang, So-Jin Kim, Sang-Hun Kim, Patricia Santofimia-Castaño, Juan L. Iovanna, Erica L. Herzog, John E. McDonough oraz Maor Sauler.

Jessica Nouws, Saul S. Siller i Tao Yang zostali wskazani jako autorzy o równym wkładzie w powstanie pracy. Koncepcję badania opracował Maor Sauler. W projektowaniu eksperymentów uczestniczyli między innymi Jessica Nouws, Tao Yang, Saul S. Siller, Sang-Hun Kim, John E. McDonough i Maor Sauler. Eksperymenty wykonywali Tao Yang, Jessica Nouws i Sang-Hun Kim, natomiast analizę danych prowadzili Saul S. Siller, Tao Yang, Jessica Nouws, So-Jin Kim oraz Maor Sauler.

Badanie było efektem współpracy wielu ośrodków. Autorzy są związani między innymi z Yale School of Medicine, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (CRCM), INSERM U1068, CNRS UMR 7258, Aix-Marseille Université, Institut Paoli-Calmettes, McMaster University School of Medicine oraz University of Michigan Medical School.

Praca została przygotowana dla American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology.

Jak przeprowadzono badanie

Projekt miał charakter wielopoziomowego badania mechanistycznego. Autorzy nie ograniczyli się do pojedynczego testu ferroptozy. Oceniali jednocześnie metabolizm żelaza, peroksydację lipidów, stres oksydacyjny, uszkodzenia DNA, funkcję mitochondriów, ekspresję genów oraz metabolom komórek, a następnie zestawili obserwacje in vitro z wynikami uzyskanymi u myszy pozbawionych Nupr1.

Modele komórkowe

Jednym z modeli była linia komórek nabłonka płuca A549. Autorzy zastosowali również komercyjnie dostępne pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzelowego (HBEC) pochodzące od trzech dawców.

Ekspresję NUPR1 obniżano przy użyciu RNA interference. Komórki otrzymywały siRNA skierowane przeciwko NUPR1 lub kontrolną pulę siRNA niezwiązaną z analizowanym celem. W większości testów funkcjonalnych materiał zbierano po dwóch 72-godzinnych cyklach transfekcji.

Ekspozycja na ekstrakt dymu papierosowego

Ekstrakt dymu papierosowego (CSE) przygotowywano z dwóch badawczych papierosów 3R4F. Dym przepuszczano przez podłoże hodowlane, a uzyskany materiał filtrowano przez filtr 0,22 µm. W części eksperymentów komórki eksponowano na 5-procentowy CSE.

W eksperymentach dotyczących ferroptozy stosowano również erastynę, która sprzyja uruchamianiu tego mechanizmu śmierci komórkowej, oraz ferrostatynę-1, inhibitor ferroptozy i peroksydacji lipidów. W doświadczeniach z pierwotnymi HBEC wykorzystywano dodatkowo chelator żelaza – deferoksaminę.

Stres oksydacyjny, żelazo i mitochondria

Wytwarzanie reaktywnych form tlenu oceniano przy użyciu CellROX Deep Red, normalizując sygnał względem zawartości mitochondriów określanej za pomocą MitoTracker Green. Do oceny oksydacyjnego uszkodzenia DNA wykorzystano 8-hydroksy-2′-deoksyguanozynę (8-OHdG).

Potencjał błony mitochondrialnej analizowano metodą wykorzystującą JC-1. Zawartość mitochondrialnego DNA określano metodą qPCR, porównując mitochondrialny gen tRNA^Leu(UUR) z jądrowym genem β2M.

Peroksydację lipidów badano przy użyciu BODIPY 581/591 C11, natomiast stężenie wewnątrzkomórkowego Fe²⁺ oceniano zestawem FerroOrange. Żywotność komórek mierzono metodą MTT, a śmierć komórkową HBEC analizowano za pomocą aneksyny V i jodku propidyny.

Mikroskopia elektronowa i model myszy

Strukturę mitochondriów oceniano przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Badano zarówno komórki A549, jak i tkankę płuc myszy Nupr1^-/-. Autorzy analizowali liczbę mitochondriów oraz struktury interpretowane jako zdarzenia związane z mitochondrialną fuzją lub podziałem.

W płucach myszy oceniano również ekspresję mitochondrialnej dysmutazy ponadtlenkowej SOD2 w komórkach AT2 oraz morfologię płuc. Część zwierząt poddano sześciomiesięcznej ekspozycji na dym papierosowy, a stopień powiększenia przestrzeni powietrznych analizowano poprzez pomiar średniej liniowej przecięcia (mean linear intercept, MLI).

Transkryptomika i metabolomika

Autorzy wykonali RNA-seq komórek A549 z prawidłową oraz obniżoną ekspresją NUPR1. Sekwencjonowanie przeprowadzono w Yale Center for Genome Analysis na platformie NovaSeq6000. Analizę wzbogacenia zestawów genów wykonano z wykorzystaniem GSEA.

Dane transkryptomiczne poddano dodatkowo analizie METAFlux, która pozwala szacować aktywność reakcji i szlaków metabolicznych na podstawie ekspresji genów oraz modelu metabolizmu komórkowego Human-GEM.

Drugą, niezależną warstwę informacji dostarczyła metabolomika oparta na chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Autorzy zastosowali system Sciex TripleTOF 6600 i analizowali zarówno zdefiniowany panel metabolitów, jak i szersze biblioteki związków.

Najważniejsze wyniki

Utrata NUPR1 zwiększa podatność komórek na ferroptozę

Pierwszym zasadniczym pytaniem było ustalenie, czy utrata NUPR1 rzeczywiście zwiększa podatność komórek nabłonka oddechowego na ferroptozę.

Po wyciszeniu NUPR1 żywotność komórek A549 w doświadczeniu z erastyną zmniejszyła się do około 54% wartości obserwowanej w komórkach kontrolnych (p=0,0324). Co więcej, wraz ze zwiększaniem stężenia erastyny żywotność komórek z niedoborem NUPR1 spadała w sposób zależny od dawki, podczas gdy w komórkach kontrolnych erastyna nie powodowała analogicznego spadku.

Istotnym elementem eksperymentu było zastosowanie ferrostatyny-1. Substancja ta ratowała żywotność komórek z wyciszonym NUPR1, co wspiera interpretację, że obserwowana śmierć komórkowa była związana z ferroptozą i peroksydacją lipidów.

W komórkach z niedoborem NUPR1 autorzy stwierdzili ponadto nasilenie indukowanej erastyną peroksydacji lipidów (p<0,0001) oraz większą akumulację Fe²⁺ (p=0,0001).

Podobny kierunek zmian odnotowano w pierwotnych HBEC. Po wyciszeniu NUPR1 ekspozycja na CSE zwiększyła odsetek umierających komórek z 7,9% do 50,6% (p<0,0001). Zastosowanie deferoksaminy częściowo ograniczyło śmierć komórek – do 38,9%.

To właśnie częściowe działanie ochronne chelatora żelaza ma duże znaczenie mechanistyczne. Jeżeli usunięcie części dostępnego żelaza ogranicza uszkodzenie komórki, wzmacnia to hipotezę o udziale procesów zależnych od żelaza. Jednocześnie ochrona była jedynie częściowa, co pokazuje, że konsekwencje utraty NUPR1 nie sprowadzają się prawdopodobnie do pojedynczego procesu.

Więcej reaktywnych form tlenu i oksydacyjnych uszkodzeń DNA

Utrata NUPR1 powodowała przesunięcie równowagi oksydacyjno-redukcyjnej. Zarówno w A549, jak i w pierwotnych HBEC stwierdzano większy sygnał reaktywnych form tlenu w komórkach z obniżoną ekspresją NUPR1. W HBEC różnica była bardzo wyraźna również po ekspozycji na CSE.

W komórkach A549 z wyciszonym NUPR1 zwiększała się także ilość 8-OHdG – wskaźnika oksydacyjnego uszkodzenia DNA – w porównaniu z komórkami kontrolnymi (p=0,0392).

Mitochondria tracą prawidłowy potencjał błonowy

Jednym z najbardziej interesujących elementów pracy jest połączenie ferroptozy z dysfunkcją mitochondriów. Po wyciszeniu NUPR1 autorzy odnotowali obniżenie potencjału błony mitochondrialnej zarówno w A549 (p=0,0348), jak i w pierwotnych HBEC (p=0,0005).

Jednocześnie obserwowano wyższe wartości wskaźników zawartości mitochondriów i mitochondrialnego DNA. W przedstawionych analizach różnice dla MitoTracker oraz mtDNA nie przekroczyły jednak klasycznego progu p<0,05 – odpowiednio p=0,0855 oraz p=0,0567. Dlatego wyniki te należy traktować ostrożniej niż jednoznacznie istotne statystycznie zmniejszenie potencjału błonowego.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa ujawniła ponadto zwiększoną częstość obrazów odpowiadających procesom mitochondrialnej fuzji lub podziału. Bez ekspozycji na CSE obserwowano je w około 50% obrazów, po ekspozycji na CSE w 68%, natomiast w komórkach z wyciszonym NUPR1 i jednoczesną ekspozycją na CSE – w 75% obrazów.

Warto podkreślić, że sama zwiększona liczba mitochondriów nie musi oznaczać sprawniejszej energetycznie komórki. Omawiane wyniki wskazują raczej na sytuację, w której komórka może zwiększać pulę mitochondriów lub zmieniać ich dynamikę, ale równocześnie mitochondria wykazują upośledzenie parametrów funkcjonalnych.

RNA-seq ujawnia przebudowę szlaków ferroptozy i funkcji mitochondrialnych

Analiza transkryptomiczna pokazała, że następstwa wyciszenia NUPR1 obejmują wiele grup genów. Zwiększyła się ekspresja między innymi LCN2, STEAP3 i GPX4, związanych z metabolizmem żelaza i ferroptozą, natomiast zmniejszyła się ekspresja SLC7A11, kodującego element antyportera cystyna/glutaminian systemu X_c^–.

Zmiany dotyczyły również genów związanych z utrzymaniem mitochondriów, mitofagią oraz ich fuzją i podziałem. Wzrosła ekspresja LONP1, PINK1, MFN2 i DNM2, natomiast zmniejszyła się ekspresja TFAM, MFN1 i OPA1.

Autorzy stwierdzili również zwiększoną ekspresję licznych genów kodujących podjednostki mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, w tym NDUFAB1, NDUFA4, NDUFS8, UQCRQ, COX8A, COX6B1, COX5B, COX7C, ATP5F1D i ATP5F1E.

Analiza wzbogacenia zestawów genów wskazała szerokie zaburzenia szlaków związanych z metabolizmem, śmiercią komórkową, odpowiedzią zapalną i funkcją mitochondriów. Część tych zmian utrzymywała się również w warunkach ekspozycji na CSE.

Utrata NUPR1 przeprogramowuje metabolizm komórki

Analiza METAFlux wykazała istotne zaburzenia wielu szlaków metabolicznych. Szczególnie wyraźne zmiany dotyczyły metabolizmu alaniny, asparaginianu i glutaminianu.

Jest to biologicznie istotne w kontekście ferroptozy, ponieważ glutaminian uczestniczy w działaniu systemu X_c^–, który wymienia wewnątrzkomórkowy glutaminian na cystynę potrzebną następnie do syntezy cysteiny i glutationu. Zaburzenie tego systemu może więc bezpośrednio wpływać na zdolność komórki do neutralizowania nadtlenków lipidowych.

METAFlux wskazywał również na istotne zmiany w glikolizie i glukoneogenezie oraz fosforylacji oksydacyjnej.

Niezależna analiza metabolomiczna LC-MS potwierdziła głęboką przebudowę metabolizmu. Profile komórek kontrolnych oraz komórek z wyciszonym NUPR1 rozdzielały się już na podstawie samego składu metabolitów.

Metabolity związane z metabolizmem alaniny, asparaginianu i glutaminianu były obniżone. Autorzy interpretują połączenie tego wyniku z przewidywaniami METAFlux jako potencjalny sygnał zwiększonego zużycia tych metabolitów po utracie NUPR1.

Jednocześnie wzrastały metabolity związane z glikolizą i glukoneogenezą, natomiast metabolity cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA) były obniżone. Łącznie dane transkryptomiczne i metabolomiczne wskazują więc nie na prostą aktywację lub zahamowanie pojedynczej drogi metabolicznej, ale na szerokie przeprogramowanie bioenergetyczne komórki.

Brak NUPR1 zmienia mitochondria również w żywym organizmie

Badacze następnie sprawdzili, czy obserwacje z hodowli komórkowych znajdują odpowiednik w organizmie. Myszy Nupr1^-/- nie wykazywały na pierwszy rzut oka ciężkiego fenotypu ogólnoustrojowego, ale dokładna analiza płuc ujawniła istotne nieprawidłowości.

W transmisyjnej mikroskopii elektronowej płuc zwierząt pozbawionych Nupr1 stwierdzono większą liczbę zdarzeń interpretowanych jako mitochondrialna fuzja lub podział (p=0,0485) oraz większą liczbę mitochondriów przypadających na obraz (p=0,0060).

W komórkach AT2 myszy Nupr1^-/- występował także wyższy poziom SOD2. Średnia intensywność fluorescencji wynosiła około 7,37 jednostki arbitralnej u myszy Nupr1^+/+ i 10,94 u Nupr1^-/- (p=0,0087). Autorzy interpretują zwiększenie SOD2 jako element odpowiedzi na nasilony stres oksydacyjny.

Najbardziej bezpośrednio związany z fenotypem rozedmowym wynik pochodził z eksperymentu sześciomiesięcznej ekspozycji zwierząt na dym papierosowy. W płucach myszy Nupr1^-/- stwierdzono większe przestrzenie powietrzne niż u zwierząt kontrolnych, a różnica w MLI była statystycznie istotna (p=0,0040).

Graficzny abstrakt zamieszczony przez autorów podsumowuje proponowany model: obecność NUPR1 wiąże się z mniejszym stresem oksydacyjnym i hamowaniem ferroptozy, zachowaniem funkcji mitochondriów oraz prawidłowej regulacji metabolizmu. Niedobór NUPR1 prowadzi natomiast w kierunku większego stresu oksydacyjnego i ferroptozy, dysfunkcji mitochondriów, zmniejszenia potencjału błony mitochondrialnej, zaburzeń metabolicznych i zmian rozedmowych.

Znaczenie dla badań nad POChP

Wyniki rozszerzają biologiczny model patogenezy POChP. NUPR1 może stanowić punkt łączący kilka procesów, które wcześniej analizowano często osobno: przewlekły stres oksydacyjny, gromadzenie żelaza, peroksydację lipidów, funkcję mitochondriów, metabolizm komórkowy oraz regulowaną śmierć komórek nabłonka.

Szczególnie istotny może być wpływ tych procesów na komórki pęcherzykowe typu 2. AT2 są nie tylko komórkami odpowiedzialnymi za produkcję surfaktantu, ale stanowią również ważny element regeneracyjny nabłonka pęcherzykowego. W odpowiednich warunkach mogą proliferować i uczestniczyć w odtwarzaniu komórek pęcherzykowych typu 1.

Autorzy proponują interesującą hipotezę dotyczącą równowagi pomiędzy przeżyciem a plastycznością AT2. Wyższa ekspresja NUPR1 może zwiększać odporność komórek na ferroptozę, natomiast w innych warunkach niższa ekspresja tego białka mogłaby sprzyjać fenotypowi bardziej plastycznemu i regeneracyjnemu.

W POChP mechanizm ten może jednak zostać patologicznie zaburzony. Przy przewlekłym uszkodzeniu i zwiększonym zapotrzebowaniu na regenerację obniżona ekspresja NUPR1 mogłaby jednocześnie pozbawiać komórki AT2 ochrony przed ferroptozą. Komórka potrzebna do naprawy pęcherzyka płucnego stawałaby się zatem bardziej podatna na śmierć dokładnie w warunkach, w których jej przeżycie jest szczególnie potrzebne.

W praktyce klinicznej omawiane wyniki nie zmieniają obecnie sposobu rozpoznawania ani leczenia POChP. Ich znaczenie jest przede wszystkim mechanistyczne. Praca identyfikuje NUPR1 jako potencjalnie ważny element biologii uszkodzonego nabłonka płuc i wskazuje kierunki dalszych badań nad ochroną komórek pęcherzykowych przed stresem oksydacyjnym i ferroptozą.

Jednocześnie kontekst biologiczny NUPR1 jest złożony. W innych tkankach, między innymi w badaniach nowotworowych, hamowanie NUPR1 analizowano jako sposób zwiększania podatności komórek na ferroptozę. W płucu objętym POChP ten sam mechanizm może działać w przeciwnym kierunku – niedobór NUPR1 może być szkodliwy dla potrzebnych organizmowi komórek nabłonkowych. Podkreśla to silną zależność funkcji NUPR1 od rodzaju komórki, choroby i warunków metabolicznych.

Ograniczenia i dalsze pytania

Autorzy podkreślają kilka ważnych ograniczeń. Chociaż wykazali ścisły związek pomiędzy niedoborem NUPR1 a zaburzeniami metabolizmu, bioenergetyki i dynamiki mitochondriów, nie ustalili jeszcze pełnego mechanizmu molekularnego odpowiedzialnego za te zmiany.

Nie wiadomo między innymi, czy NUPR1 bezpośrednio reguluje główne białka odpowiedzialne za mitochondrialną fuzję i podział – takie jak DRP1, MFN1, MFN2 czy OPA1 – czy też zmiany morfologiczne mitochondriów są wtórnym następstwem szerszego przeprogramowania metabolicznego i odpowiedzi na stres.

W badaniu nie przeprowadzono lipidomiki. Jest to istotne, ponieważ metabolizm lipidów ma szczególne znaczenie zarówno dla ferroptozy, jak i dla fizjologii komórek AT2 odpowiedzialnych za produkcję surfaktantu.

Autorzy zwracają również uwagę na ograniczenia modelu wykorzystującego ekstrakt dymu papierosowego. Skład CSE może różnić się pomiędzy przygotowanymi partiami. Aby zwiększyć wewnętrzną spójność eksperymentów, badacze korzystali z jednej partii ekstraktu, ale sam problem zmienności tego modelu pozostaje.

Część analiz morfologicznych była wykonywana bez zaślepienia osoby oceniającej obrazy. W doświadczeniu dotyczącym ultrastruktury mitochondriów w płucach liczba myszy wynosiła jedynie dwa zwierzęta na grupę, chociaż poszczególne analizy obejmowały większą liczbę obrazów. W eksperymencie dotyczącym powiększenia przestrzeni powietrznych po sześciu miesiącach ekspozycji na dym oceniano cztery myszy Nupr1^+/+ i osiem Nupr1^-/-.

Warto również pamiętać, że model komórkowy A549 nie jest tożsamy z prawidłową ludzką komórką AT2, natomiast pierwotne HBEC są komórkami nabłonka oskrzelowego. Wyniki z hodowli komórkowych i modeli mysich wymagają więc potwierdzenia w badaniach bezpośrednio odnoszących się do biologii ludzkiego pęcherzyka płucnego i przebiegu POChP.

Otwarte pozostaje także podstawowe pytanie: dlaczego ekspresja NUPR1 zmniejsza się w płucach osób z POChP? Autorzy wskazują między innymi na możliwy udział regulacji epigenetycznej, ale mechanizm ten nie został jeszcze ustalony.

Istotne będą zatem dalsze badania określające, czy zmniejszenie NUPR1 jest przyczynowym elementem rozwoju choroby, następstwem przewlekłego stresu komórkowego czy elementem bardziej złożonego programu adaptacyjnego, który w warunkach POChP staje się niekorzystny.

Finansowanie i konflikty interesów

Saul S. Siller był wspierany przez grant T32 GM086287 z National Institute of General Medical Sciences. Maor Sauler zgłosił finansowanie grantowe i zwrot kosztów podróży od Genentech i AstraZeneca oraz wynagrodzenia konsultacyjne i zwrot kosztów podróży od Regeneron/Sanofi.