Sekwencjonowanie DNA w mukowiscydozie: szybsza identyfikacja zakażeń płuc i pełniejszy obraz mikrobiomu

Sekwencjonowanie DNA coraz wyraźniej zmienia sposób, w jaki badacze patrzą na przewlekłe i nawracające zakażenia dróg oddechowych u osób z mukowiscydozą. Zamiast ograniczać diagnostykę do poszukiwania pojedynczych drobnoustrojów możliwych do wyhodowania w laboratorium, metody molekularne pozwalają analizować całe społeczności bakterii, wirusów i grzybów, a w przypadku bardziej zaawansowanych technik także wykrywać geny oporności na antybiotyki, czynniki zjadliwości oraz różnice pomiędzy szczepami. Autorzy nowego przeglądu opublikowanego w Clinical Microbiology Reviews wskazują, że takie podejście może w przyszłości umożliwić szybszą identyfikację zakażeń i bardziej precyzyjny dobór leczenia przeciwdrobnoustrojowego. Jednocześnie podkreślają, że kliniczna metagenomika w mukowiscydozie nadal pozostaje na etapie translacji do rutynowej praktyki i nie może być obecnie traktowana jako prosty zamiennik klasycznej mikrobiologii.

Dlaczego zakażenia dróg oddechowych pozostają kluczowym problemem w mukowiscydozie

Mukowiscydoza jest chorobą genetyczną wynikającą z patogennych wariantów genu CFTR, prowadzących do zaburzenia funkcji białka CFTR i transportu jonów przez powierzchnie nabłonkowe. W układzie oddechowym konsekwencją jest między innymi nieprawidłowe uwodnienie powierzchni dróg oddechowych, powstawanie gęstej wydzieliny oraz upośledzenie klirensu śluzowo-rzęskowego.

Warunki te sprzyjają utrzymywaniu się drobnoustrojów, tworzeniu biofilmu, przewlekłej odpowiedzi zapalnej oraz kolejnym epizodom zaostrzeń płucnych. W przebiegu choroby mogą pojawiać się między innymi Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, bakterie należące do kompleksu Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter spp. czy prątki niegruźlicze. Znaczenie kliniczne poszczególnych drobnoustrojów zależy jednak od wieku chorego, stadium choroby, przewlekłości zakażenia, stosowanego leczenia i szeregu cech konkretnego szczepu.

Tradycyjne podejście mikrobiologiczne opiera się przede wszystkim na hodowli materiału z dróg oddechowych, identyfikacji wyhodowanych drobnoustrojów oraz oznaczaniu ich lekowrażliwości. Metody te pozostają podstawowym elementem opieki nad chorymi z mukowiscydozą i dostarczają informacji bezpośrednio przydatnych przy podejmowaniu decyzji terapeutycznych.

Problem polega na tym, że materiał pobrany z dróg oddechowych nie jest prostą mieszaniną jednego patogenu i komórek gospodarza. To złożony ekosystem, którego część mikroorganizmów trudno wyhodować standardowymi metodami, część występuje w małej liczebności, a część może pozostawać w interakcjach z innymi drobnoustrojami. Klasyczny posiew daje więc ważną, ale niepełną informację o mikrobiologicznej strukturze tego środowiska.

Od posiewu do sekwencjonowania całej społeczności mikroorganizmów

Najważniejsza zmiana wprowadzona przez sekwencjonowanie polega na odejściu od pytania: „jaki drobnoustrój udało się wyhodować?” w kierunku znacznie szerszego pytania: „jakie mikroorganizmy oraz ich materiał genetyczny znajdują się w badanej próbce?”.

Takie podejście jest szczególnie interesujące w mukowiscydozie, ponieważ zakażenie dróg oddechowych może mieć charakter polimikrobiologiczny. Bakterie potencjalnie patogenne funkcjonują w środowisku obejmującym inne bakterie, grzyby, wirusy, bakteriofagi oraz dużą ilość materiału biologicznego gospodarza. Wzajemne interakcje mogą wpływać na metabolizm, tworzenie biofilmu, odpowiedź na antybiotyki i odpowiedź zapalną organizmu.

W pracy zespołu Jessica A. P. Carlson-Jones i współautorów podkreślono, że sekwencjonowanie ujawniło znacznie większą złożoność mikrobiomu dróg oddechowych w mukowiscydozie niż sugerował obraz uzyskiwany wyłącznie na podstawie tradycyjnej hodowli.

Autorzy dokonali również przeglądu zasobów NCBI BioProjects i zidentyfikowali 132 zbiory danych wykorzystujące sekwencjonowanie 16S materiału z plwociny osób z mukowiscydozą. Mediana liczby próbek w tych zbiorach wynosiła 75, a tylko 50 spośród nich, czyli około 38%, obejmowało ponad 100 próbek. Pokazuje to, że baza danych dotyczących mikrobiomu CF szybko rośnie, ale znaczna część badań nadal pozostaje relatywnie niewielka.

16S rRNA – dobry obraz bakterii, ale nie całej infekcji

Sekwencjonowanie fragmentów genu 16S rRNA jest jedną z najczęściej stosowanych metod badania mikrobiomu bakteryjnego. Wykorzystuje różnice w sekwencjach konserwowanego genu obecnego u bakterii, pozwalając określić skład taksonomiczny próbki bez konieczności hodowli każdego wykrywanego drobnoustroju.

Metoda jest relatywnie dostępna i dobrze nadaje się do badania struktury społeczności bakteryjnej. Ma jednak zasadnicze ograniczenia. Zwykle nie daje takiej rozdzielczości na poziomie szczepów jak pełne sekwencjonowanie genomowe, nie przedstawia całego zestawu genów obecnych w próbce i nie charakteryzuje w sposób kompleksowy wirusów czy grzybów.

Shotgun metagenomics – znacznie więcej niż lista bakterii

Bardziej zaawansowaną metodą jest metagenomowe sekwencjonowanie typu shotgun. Zamiast amplifikować jeden wybrany gen, analizuje się ogromną liczbę fragmentów DNA obecnych w próbce. Odpowiednia analiza bioinformatyczna może następnie przyporządkować sekwencje do konkretnych mikroorganizmów i genów.

W przypadku materiału z dróg oddechowych daje to potencjalną możliwość równoczesnej oceny składu społeczności drobnoustrojów, identyfikowania wariantów na poziomie szczepów, wykrywania genów związanych z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe, poszukiwania determinant zjadliwości oraz badania funkcjonalnego potencjału mikrobiomu.

Metatranskryptomika i wiromika

Jeszcze innym poziomem analizy jest metatranskryptomika, koncentrująca się na RNA i aktywności transkrypcyjnej mikroorganizmów. Sama obecność DNA nie musi bowiem oznaczać, że dany organizm jest aktywny metabolicznie lub odgrywa aktualnie dominującą rolę w procesie chorobowym.

Z kolei analizy wiromu umożliwiają dokładniejsze poznanie wirusów obecnych w środowisku dróg oddechowych, w tym bakteriofagów. Te ostatnie mogą wpływać na strukturę populacji bakteryjnych, transfer materiału genetycznego i ewolucję bakterii.

Co może pokazać sekwencjonowanie, czego nie widzi klasyczny posiew

Jednym z najważniejszych argumentów przemawiających za rozwojem klinicznej metagenomiki jest możliwość jednoczesnego spojrzenia na całe środowisko mikrobiologiczne próbki. Ma to szczególne znaczenie w przewlekłych zakażeniach, gdzie klinicznie istotna może być nie tylko obecność określonego gatunku, lecz także ewolucja jego populacji w czasie.

Pseudomonas aeruginosa podczas wieloletniej obecności w drogach oddechowych może podlegać selekcji i adaptacji do specyficznego środowiska płuc pacjenta. Poszczególne subpopulacje tego samego gatunku mogą różnić się fenotypem, metabolizmem, zdolnością tworzenia biofilmu, wrażliwością na antybiotyki czy zestawem mechanizmów oporności.

Sekwencjonowanie o odpowiedniej rozdzielczości potencjalnie pozwala obserwować takie zmiany na poziomie genomowym. Ma to znaczenie dla koncepcji nadzoru mikrobiologicznego prowadzonego nie tylko w momencie zaostrzenia, lecz również w sposób podłużny – poprzez porównywanie materiału pobieranego od konkretnego chorego w kolejnych punktach czasowych.

Autorzy przeglądu zwracają również uwagę na możliwość wykrywania determinant oporności na antybiotyki. W perspektywie diagnostycznej szczególnie interesujące byłoby połączenie szybkiej identyfikacji patogenu z rozpoznawaniem genów oporności jeszcze przed uzyskaniem klasycznego wyniku hodowli i oznaczenia lekowrażliwości.

Nie oznacza to jednak, że obecność genu oporności można automatycznie przeliczyć na kliniczny antybiogram. Zależność między genotypem i fenotypem bywa złożona, a ekspresja mechanizmu oporności, jego znaczenie biologiczne oraz udział konkretnego szczepu w całej próbce wymagają odpowiedniej interpretacji.

Technologie długich odczytów i urządzenia przenośne

Szczególną uwagę badaczy przyciągają platformy Oxford Nanopore. W przeciwieństwie do klasycznych technologii krótkich odczytów mogą one generować znacznie dłuższe fragmenty sekwencji DNA, a odczyty stają się dostępne podczas trwania analizy. Otwiera to możliwość prowadzenia procesu niemal w czasie rzeczywistym.

Niektóre sekwenatory są niewielkie i mogą współpracować bezpośrednio z komputerem przenośnym. Autorzy informacji prasowej wskazują dlatego potencjał ich wykorzystania nie tylko w dużych laboratoriach referencyjnych, lecz także w szpitalach położonych w regionach oddalonych od dużych ośrodków.

Technologia pozwala ponadto na tzw. adaptive sampling, czyli programowe decydowanie już podczas sekwencjonowania, które cząsteczki DNA mają być dalej odczytywane, a które odrzucone. Koncepcja ta może być wykorzystywana do wzbogacania materiału mikrobiologicznego albo ograniczania dominującego DNA człowieka. Wyniki poszczególnych badań wskazują jednak, że skuteczność takich strategii zależy od rodzaju próbki i zastosowanego protokołu.

Modulatory CFTR zmieniają środowisko dróg oddechowych

Rozwój sekwencjonowania nakłada się na inną fundamentalną zmianę w mukowiscydozie – coraz szersze stosowanie wysoko skutecznych terapii modulatorami CFTR. Leki te wpływają na podstawowy defekt molekularny choroby, a u kwalifikujących się pacjentów mogą prowadzić między innymi do poprawy czynności płuc, stanu odżywienia oraz zmniejszenia częstości zaostrzeń.

Zmiana fizjologii dróg oddechowych oznacza jednak również zmianę środowiska, w którym przez wiele lat funkcjonowały specyficzne społeczności mikroorganizmów. Pojawia się zatem ważne pytanie: co dzieje się z mikrobiomem płuc po rozpoczęciu skutecznej terapii modulującej CFTR?

To nie jest wyłącznie kwestia zmniejszenia liczby znanych patogenów. Zmiany właściwości śluzu, klirensu śluzowo-rzęskowego, stanu zapalnego, częstości antybiotykoterapii oraz ekspozycji na kolejne leki mogą prowadzić do przebudowy całego ekosystemu mikrobiologicznego.

Autorzy przeglądu wskazują, że sekwencjonowanie daje wyjątkową możliwość obserwowania tych procesów w epoce modulatorów CFTR. Znaczenie takiego podejścia wspierają również nowsze dane prospektywne. W badaniu fazy IV IMMProveCF analizowano mikrobiom plwociny, gardła i jelit przed oraz po rozpoczęciu leczenia elexakaftorem, tezakaftorem i iwakaftorem, wskazując, że poprawie fizjologii gospodarza może towarzyszyć przebudowa mikrobiomu. ^[2]

Jest to ważne także z punktu widzenia długoterminowego nadzoru. Pacjent, u którego poprawiły się parametry kliniczne i który rzadziej produkuje plwocinę, może jednocześnie wymagać nowych strategii pobierania materiału biologicznego. Paradoksalnie sukces terapii podstawowej może więc utrudniać stosowanie jednego z tradycyjnych materiałów wykorzystywanych w monitorowaniu mikrobiologicznym.

Czy metagenomika może wpływać na dobór antybiotykoterapii

Najbardziej interesującym klinicznie zastosowaniem sekwencjonowania byłoby skrócenie czasu pomiędzy pobraniem próbki a uzyskaniem informacji umożliwiającej dostosowanie antybiotykoterapii. Ma to szczególne znaczenie w ciężkich zakażeniach dróg oddechowych, w których początkowo konieczne jest stosowanie terapii empirycznej.

Dowodów na możliwość zastosowania takiej strategii dostarczają już doświadczenia spoza samej mukowiscydozy. W pilotażowej usłudze metagenomiki oddechowej prowadzonej na oddziałach intensywnej terapii Guy’s and St Thomas’ NHS Foundation Trust w Londynie przeanalizowano 128 próbek od 87 pacjentów z podejrzeniem zakażenia dolnych dróg oddechowych. ^[1]

W pierwszych 15 tygodniach działania programu wynik tego samego dnia uzyskano dla 110 próbek, czyli 86% analiz, a mediana czasu od rozpoczęcia procedury do wyniku wynosiła 6,7 godziny. Metagenomika osiągnęła 93% czułości i 81% swoistości w odniesieniu do klinicznie istotnych patogenów w porównaniu z rutynową diagnostyką. Co szczególnie istotne, 48% wyników wpłynęło na zmianę leczenia przeciwdrobnoustrojowego – zarówno poprzez jego eskalację, jak i deeskalację. ^[1]

Nie są to wyniki pochodzące z populacji chorych na mukowiscydozę i nie można ich bezpośrednio przenosić na przewlekłe zakażenia CF. Pokazują jednak, że szybka metagenomika oddechowa może zostać zorganizowana jako rzeczywista usługa kliniczna i dostarczać informacji w czasie pozwalającym na wykorzystanie ich podczas bieżącego leczenia chorego.

Kolejne badania prowadzone w intensywnej terapii rozwijają tę koncepcję w kierunku szybkiej diagnostyki pan-mikrobiologicznej, obejmującej równoczesne poszukiwanie różnych klas drobnoustrojów i danych potencjalnie istotnych dla personalizacji leczenia.

Potencjał dla racjonalnej antybiotykoterapii

W mukowiscydozie jest to szczególnie ważne ze względu na dużą skumulowaną ekspozycję wielu chorych na antybiotyki. Terapia przeciwdrobnoustrojowa pozostaje niezbędnym elementem leczenia zakażeń i zaostrzeń, ale jednocześnie wywiera presję selekcyjną na drobnoustroje oraz może wpływać na strukturę całego mikrobiomu.

Szybsze ustalenie prawdopodobnej etiologii zakażenia mogłoby potencjalnie ograniczać czas niepotrzebnej terapii o bardzo szerokim spektrum. Równie ważna byłaby możliwość rozpoznawania sytuacji, w których drobnoustrój rutynowo niewykrywany lub trudny do hodowli może być istotnym elementem obrazu klinicznego.

Jednocześnie interpretacja musi uwzględniać podstawową cechę bardzo czułych metod molekularnych: wykrycie materiału genetycznego mikroorganizmu nie jest równoznaczne z wykazaniem, że właśnie on odpowiada za aktualne zaostrzenie choroby.

Najważniejsze bariery przed rutynowym zastosowaniem klinicznym

Perspektywa uzyskiwania szerokiego profilu mikrobiologicznego w ciągu godzin jest atrakcyjna, ale droga do rutynowej diagnostyki jest znacznie bardziej skomplikowana niż samo zwiększenie szybkości sekwenatorów. Autorzy przeglądu wskazują kilka problemów biologicznych, technicznych, bioinformatycznych i organizacyjnych.

Gęsta plwocina jest trudnym materiałem analitycznym

Plwocina osób z mukowiscydozą jest materiałem o dużej lepkości i bardzo złożonym składzie. Zawiera mucyny, komórki zapalne, DNA pozakomórkowe, komórki nabłonka, drobnoustroje i liczne inne składniki. Efektywne uwolnienie reprezentatywnej puli DNA wszystkich mikroorganizmów bez wprowadzania systematycznych zaburzeń wymaga odpowiednio wystandaryzowanych procedur przygotowania próbki.

DNA człowieka może zdominować wynik

Jednym z największych problemów metagenomiki materiału oddechowego jest ogromna przewaga DNA gospodarza nad DNA mikroorganizmów. Jeżeli zdecydowana większość odczytów pochodzi z komórek człowieka, znacząca część możliwości sekwenatora jest wykorzystywana do analizowania materiału, który z punktu widzenia diagnostyki zakażenia nie jest celem badania.

Dlatego rozwijane są metody selektywnego usuwania DNA gospodarza, chemicznego lub enzymatycznego wzbogacania materiału mikrobiologicznego, ukierunkowanego wychwytywania określonych sekwencji oraz adaptacyjnego sekwencjonowania.

Więcej danych oznacza trudniejszą interpretację

Posiew dodatni w kierunku określonego patogenu daje wynik, który lekarz i mikrobiolog potrafią umieścić w znanym kontekście klinicznym. Metagenomika może natomiast zwrócić informacje o dziesiątkach lub setkach taksonów, genach oporności, elementach mobilnych i sekwencjach o niejasnym znaczeniu.

Powstaje zatem problem odróżnienia organizmów klinicznie istotnych od mikrobioty tła, zanieczyszczenia laboratoryjnego i materiału genetycznego pochodzącego od mikroorganizmów, które nie odgrywają aktualnie roli w chorobie.

W przypadku dróg oddechowych szczególnie ważne jest również ryzyko zanieczyszczenia materiału mikrobiotą górnych dróg oddechowych podczas pobierania próbki. Sposób pozyskania materiału może więc wpływać na późniejszy profil mikrobiologiczny.

Gen oporności nie zawsze oznacza fenotypową oporność

Wykrywanie genów związanych z opornością na antybiotyki jest jednym z najbardziej atrakcyjnych kierunków rozwoju diagnostyki genomowej. Nadal jednak trzeba zachować rozróżnienie między rezystomem – czyli zestawem genów potencjalnie związanych z opornością – a fenotypową odpowiedzią konkretnego izolatu na lek.

Nie każdy wykryty gen musi być aktywnie eksprymowany, nie zawsze wiadomo, do którego organizmu w złożonej próbce należy, a niektóre mechanizmy oporności wynikają z mutacji chromosomalnych lub kombinacji wielu zmian. Z tego względu pełne zastąpienie klasycznych oznaczeń lekowrażliwości wyłącznie analizą genetyczną wymaga bardzo dokładnej walidacji dla poszczególnych patogenów i klas antybiotyków.

Standaryzacja i kontrola jakości

Aby wynik metagenomiczny mógł wpływać na decyzje kliniczne, laboratoria muszą uzyskiwać wyniki porównywalne i powtarzalne. Konieczne jest zatem określenie standardów dotyczących pobierania i przechowywania próbek, przygotowania materiału, ekstrakcji DNA, tworzenia bibliotek, parametrów sekwencjonowania, kontroli ujemnych i dodatnich, baz referencyjnych oraz algorytmów bioinformatycznych.

Różnice na którymkolwiek z tych etapów mogą zmieniać końcowy profil mikrobiologiczny. W badaniach naukowych jest to problem metodologiczny; w diagnostyce klinicznej może mieć bezpośrednie konsekwencje dla leczenia.

Bioinformatyka musi stać się elementem diagnostyki klinicznej

Metagenomika wymaga znacznie większego zaplecza informatycznego niż standardowy posiew. Laboratorium musi dysponować nie tylko sekwenatorem, lecz także zwalidowanym pipeline’em analitycznym, aktualnymi bazami danych, odpowiednią infrastrukturą obliczeniową i kompetencjami umożliwiającymi interpretację wyniku.

Wyzwaniem jest ponadto przedstawienie informacji w formie przydatnej lekarzowi. Raport zawierający tysiące nazw genów i mikroorganizmów byłby klinicznie mało użyteczny. Ostateczny wynik musi odpowiadać na pytania istotne dla konkretnego przypadku, a jego ograniczenia powinny być jasno komunikowane.

Autorzy i ośrodki badawcze

Przegląd przygotował międzynarodowy, interdyscyplinarny zespół łączący mikrobiologię, bioinformatykę i medycynę kliniczną. Pierwszą autorką jest dr Jessica A. P. Carlson-Jones z Flinders Accelerator for Microbiome Exploration przy Flinders University, prowadząca badania nad mikrobiomami związanymi między innymi z układem oddechowym.

Wśród autorów znajduje się również dr Thomas R. Goddard, pediatryczny specjalista chorób układu oddechowego i medycyny snu oraz kierownik Department of Respiratory & Sleep Medicine w Women’s and Children’s Hospital w Adelaide.

Prof. Robert A. Edwards z Flinders University jest specjalistą bioinformatyki, genomiki i badań nad mikrobiomem. Z zespołem współpracowali również m.in. prof. Katrine L. Whiteson z University of California Irvine, Associate Professor Morgyn S. Warner z SA Pathology i Royal Adelaide Hospital, Associate Professor Judith M. Morton kierująca South Australia Adult Cystic Fibrosis Service w Royal Adelaide Hospital oraz prof. Hubertus P. A. Jersmann związany z Adelaide University i Royal Adelaide Hospital.

Co może zmienić się w kolejnych latach

Najbliższy etap rozwoju prawdopodobnie będzie polegał przede wszystkim na walidacji szybkich procedur diagnostycznych w rzeczywistych warunkach klinicznych. Należy ustalić, w jakich sytuacjach metagenomika rzeczywiście poprawia wynik diagnostyczny, skraca czas do właściwej terapii, pozwala bezpiecznie ograniczyć antybiotykoterapię o szerokim spektrum i prowadzi do poprawy wyników leczenia.

W mukowiscydozie szczególnie interesujący będzie długoterminowy nadzór nad mikrobiomem w epoce wysoko skutecznych modulatorów CFTR. Pacjenci żyją dłużej, zmienia się naturalny przebieg choroby, poprawia się funkcja dróg oddechowych, a jednocześnie część przewlekłych zakażeń i zmian mikrobiologicznych powstała wiele lat przed rozpoczęciem leczenia modulującego.

Możliwe, że w przyszłości zamiast analizowania jedynie listy wyhodowanych drobnoustrojów lekarze będą obserwować również dynamikę całego ekosystemu: pojawianie się nowych szczepów, zmiany udziału poszczególnych mikroorganizmów, ewolucję genów oporności i odpowiedź mikrobiomu na kolejne interwencje.

Tak rozumiana mikrobiologia precyzyjna nie oznacza jednak rezygnacji z klasycznych metod. Najbardziej prawdopodobny scenariusz rozwoju to stopniowa integracja hodowli, badań molekularnych, sekwencjonowania oraz informacji klinicznych w jeden system diagnostyczny.