Pseudomonas aeruginosa przemieszcza się między płatami płuca i ewoluuje równolegle w mukowiscydozie

Przewlekłe zakażenie Pseudomonas aeruginosa w mukowiscydozie może być znacznie bardziej złożone, niż sugerowałaby charakterystyka pojedynczego izolatu pobranego z dróg oddechowych. Naukowcy przeanalizowali całe genomy 450 izolatów bakterii uzyskanych z różnych płatów prawego płuca tej samej osoby z mukowiscydozą podczas trzech pobrań przeprowadzonych w okresie około 1,5 roku. W obrębie jednej przewlekłej infekcji wykazano pięć głównych linii filogenetycznych, czasowo zmieniającą się strukturę przestrzenną populacji, liczne wnioskowane zdarzenia migracji pomiędzy płatami oraz równoległe powstawanie zmian genetycznych związanych m.in. z produkcją alginianu i mechanizmami oporności na antybiotyki. Badanie opublikowano 25 sierpnia 2026 roku w czasopiśmie mSystems.

Jak przeprowadzono badanie?

Zespół kierowany przez badaczy związanych przede wszystkim z Geisel School of Medicine at Dartmouth oraz University of Illinois Urbana-Champaign analizował przestrzenną i czasową strukturę populacji Pseudomonas aeruginosa w przewlekłym zakażeniu płuc osoby z mukowiscydozą.

Badaczy interesowało, czy poszczególne subpopulacje bakterii pozostają przez długi czas ograniczone do konkretnych regionów płuca, czy mogą się pomiędzy nimi przemieszczać oraz czy różne lokalne środowiska sprzyjają powstawaniu odmiennych trajektorii ewolucyjnych.

Materiał pochodził od dorosłego mężczyzny z mukowiscydozą w wieku 30–35 lat, u którego autorzy określili chorobę płuc jako łagodną do umiarkowanej. Średnie FEV₁ w okresie badania wynosiło około 94% wartości należnej, natomiast podczas zaostrzeń płucnych zmniejszało się do około 75% wartości należnej.

Przed pierwszym pobraniem materiału kliniczne posiewy plwociny dokumentowały obecność zarówno śluzowych, jak i nieśluzowych wariantów P. aeruginosa przez ponad osiem lat. W czasie objętym analizą pacjent otrzymywał różne leki przeciwdrobnoustrojowe, w tym m.in. azytromycynę, ceftazydym, tobramycynę, cyprofloksacynę, piperacylinę z tazobaktamem, doksycyklinę i trimetoprim z sulfametoksazolem.

Podczas bronchoskopii wykonywano płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe – BAL – oddzielnie w prawym płacie górnym, środkowym i dolnym. Materiał pobierano w trzech punktach czasowych w okresie około 1,5 roku. W trzecim punkcie czasowym nie uzyskano próbki ze środkowego płata.

Łącznie wyizolowano 527 szczepów P. aeruginosa. Wszystkie poddano sekwencjonowaniu krótkich odczytów w technologii Illumina. Po zastosowaniu kryteriów kontroli jakości dotyczących m.in. głębokości odczytu i wiarygodności przypisania wariantów do dalszych analiz zakwalifikowano 450 genomów.

Wszystkie izolaty należały do typu sekwencyjnego MLST ST499, co było zgodne ze wspólnym pochodzeniem analizowanej populacji zakażenia. Jako wewnętrzny genom referencyjny wykorzystano izolat T1_LL_B5, który dodatkowo zsekwencjonowano technologią długich odczytów Nanopore i skorygowano przy użyciu danych Illumina.

Wśród 450 genomów wykryto 663 wysokiej jakości zmienne pozycje SNP. Obejmowały one 401 wariantów niesynonimicznych, 198 wariantów synonimicznych i 64 warianty w regionach międzygenowych. Analizowano również insercje i delecje.

Pięć linii Pseudomonas aeruginosa w jednym płucu

Analizy filogenetyczne wykazały, że populację można podzielić na pięć głównych klastrów, czyli linii filogenetycznych. Poszczególne linie nie odpowiadały jednak w prosty sposób konkretnym płatom płuca. W każdym z głównych klastrów znajdowano izolaty pochodzące z różnych punktów czasowych i różnych badanych regionów.

Jednocześnie w określonych momentach obserwowano wzbogacenie poszczególnych płatów w określone genotypy. Oznacza to, że dana linia mogła czasowo dominować w określonym regionie płuca, jednak taka przestrzenna segregacja nie była stabilna w całym okresie badania.

Badacze ocenili także tempo gromadzenia zmian genetycznych. Regresja odległości genetycznej od ostatniego wspólnego przodka względem czasu wskazała na średnie tempo około 0,02 mutacji na dobę w całej analizowanej populacji. Nachylenie było istotnie większe od zera w teście permutacyjnym (p < 1 × 10⁻⁴).

Tempo ewolucji nie było jednakowe dla wszystkich linii. Izolaty klastra 1 nie wykazywały w analizowanym okresie wzrostu dywergencji względem ostatniego wspólnego przodka, podczas gdy inne linie ewoluowały szybciej. Klaster 1 był najmniej odległy od przodka analizowanej populacji, a jego przedstawiciele występowali głównie w górnym płacie prawego płuca.

Na podstawie modelu zegara molekularnego autorzy oszacowali czas ostatniego wspólnego przodka wszystkich pobranych izolatów na około 4,1 roku przed pierwszym punktem czasowym, z 95-procentowym przedziałem największej gęstości posteriorowej wynoszącym 1,8–7,2 roku. Nie należy utożsamiać tej wartości z momentem rozpoczęcia infekcji: kliniczne posiewy dokumentowały obecność P. aeruginosa już ponad osiem lat przed pierwszym pobraniem BAL.

Zmieniająca się struktura przestrzenna i migracja między płatami

Jednym z najważniejszych elementów badania było połączenie danych genomicznych z informacją o miejscu pobrania każdego izolatu. Naukowcy chcieli ustalić, czy płaty płuca działają jak względnie odizolowane nisze, w których bakterie ewoluują przede wszystkim lokalnie.

Do rekonstrukcji zmian w czasie wykorzystano model filogenetyczny z relaksowanym zegarem molekularnym zaimplementowany w BEAST2. Lokalizację anatomiczną traktowano jako cechę dyskretną i na tej podstawie wnioskowano o potencjalnych przemieszczeniach linii pomiędzy płatami.

W drzewach pobranych z rozkładu posteriorowego stwierdzono średnio 32,9 par węzłów rodzic–potomek, w których zmieniała się przypisana lokalizacja w płucu. Autorzy interpretowali takie przejścia jako zdarzenia migracji pomiędzy płatami.

Najczęściej wnioskowany kierunek prowadził z płata dolnego do górnego, następnie z górnego do środkowego oraz ze środkowego do dolnego. Przejścia w kierunkach przeciwnych były znacznie rzadsze. Autorzy uznali taki rozkład za zgodny z możliwością cyklicznego przemieszczania się linii pomiędzy częściami prawego płuca.

FST pokazuje, że przestrzenna struktura infekcji zmieniała się w czasie

Dodatkowych informacji dostarczyła analiza współczynnika F_ST, wykorzystywanego do oceny zróżnicowania genetycznego pomiędzy populacjami.

W pierwszym punkcie czasowym F_ST pomiędzy badanymi płatami wynosiło około 0,35–0,37, co wskazywało na wyraźne zróżnicowanie przestrzenne i było zgodne z częściową kompartmentalizacją bakterii w różnych regionach płuca.

W drugim punkcie czasowym struktura uległa znacznej zmianie. Populacje górnego i dolnego płata wykazywały bardzo małe zróżnicowanie – F_ST wynosiło 0,069 – co autorzy interpretowali jako wynik znacznego wymieszania lub redystrybucji bakterii pomiędzy tymi regionami. Jednocześnie populacja płata środkowego była silnie zróżnicowana w stosunku do obu pozostałych, z F_ST wynoszącym około 0,60–0,71.

W trzecim punkcie czasowym przestrzenne zróżnicowanie ponownie stało się wyraźne. Dla górnego i dolnego płata F_ST wynosiło 0,477. Z kolei porównanie populacji górnego płata z pierwszego i trzeciego punktu czasowego dało F_ST równe 0,058, wskazując na niewielkie zróżnicowanie pomiędzy tymi populacjami. Autorzy uznali ten wynik za zgodny z utrzymywaniem się lub ponowną ekspansją wolniej ewoluującej linii przodków.

Autorzy opisują migrację jako nieciągłą w czasie. Szczególnie wyraźne wymieszanie pomiędzy górnym i dolnym płatem pojawiło się w okolicy drugiego punktu pobrania. W podobnym okresie do leczenia wprowadzono cyprofloksacynę. Badanie nie pozwala jednak stwierdzić, że zmiana antybiotykoterapii spowodowała migrację bakterii – autorzy przedstawiają zmianę stanu choroby i leczenia jedynie jako możliwe czynniki towarzyszące.

Równoległa adaptacja i zmiany fenotypu śluzowego

W toku przewlekłego zakażenia bakterie gromadziły zmiany w genach już wcześniej wiązanych z adaptacją P. aeruginosa do organizmu człowieka. Mutacje typu missense i nonsense wykryto w 333 różnych otwartych ramkach odczytu odpowiadających genom referencyjnym PAO1. Aż 91% tych genów było zmienionych wyłącznie w pojedynczych izolatach.

Jednocześnie 22 geny posiadały mutacje w dwóch lub większej liczbie odrębnych linii. Taki wzorzec wskazuje na ewolucję równoległą i może świadczyć o powtarzalnym działaniu podobnych presji selekcyjnych na różne subpopulacje.

Mutacja lasR była obecna w całej analizowanej populacji

We wszystkich 450 genomach stwierdzono tę samą mutację nonsensowną genu lasR. Zmiana nukleotydu C135T powodowała powstanie przedwczesnego kodonu stop w pozycji Gln45 – Q45*.

Na podstawie jej obecności we wszystkich badanych izolatach autorzy wnioskują, że mutacja mogła być obecna już w szczepie rozpoczynającym zakażenie albo osiągnęła dominację w populacji prawego płuca jeszcze przed rozpoczęciem analiz.

lasR koduje regulator transkrypcyjny odgrywający istotną rolę w quorum sensing. Mutacje prowadzące do utraty jego funkcji są dobrze znanym elementem adaptacji P. aeruginosa podczas przewlekłego zakażenia dróg oddechowych w mukowiscydozie.

mucA, algU i algB wpływały na śluzowy fenotyp bakterii

Wszystkie 450 genomów posiadało również identyczną zmianę w genie mucA: delecję pojedynczego nukleotydu po pozycji aminokwasowej 143. Powodowała ona przesunięcie ramki odczytu, zmianę kolejnych aminokwasów i przedwczesne zakończenie translacji, prowadząc do skrócenia białka MucA.

Utrata funkcji MucA sprzyja zwiększeniu aktywności AlgU i produkcji egzopolisacharydu alginianu, charakterystycznej dla śluzowego fenotypu P. aeruginosa. Mimo wspólnej mutacji mucA nie wszystkie izolaty zachowywały jednak fenotyp śluzowy.

W klastrze 1 zidentyfikowano dziewięć niesynonimicznych mutacji algU, w tym cztery mutacje nonsensowne i pięć zmian typu missense. Poza klastrem 1 wszystkie izolaty – z jednym opisanym wyjątkiem – posiadały mutację nonsensowną S199* w algB. Niewielka grupa izolatów klastra 5 miała ponadto dodatkową, niezależną mutację W191* w AlgB.

Fenotypowa analiza izolatów wskazała, że zmiany algU lub algB na tle utraty funkcji mucA wiązały się z zanikiem śluzowego fenotypu. Autorzy interpretują ten proces jako wielokrotne, niezależne odwracanie fenotypu śluzowego w różnych liniach bakteryjnych.

Izolaty śluzowe występowały najczęściej w próbkach z górnego płata prawego płuca, natomiast ich ogólna częstość zmniejszała się w kolejnych punktach czasowych.

Różnice w oporności na antybiotyki

Analiza genomowa wykazała liczne niesynonimiczne mutacje w genach związanych z wielolekowymi pompami efflux, czyli systemami aktywnego usuwania różnych substancji z komórki bakteryjnej. Mechanizmy te mogą wpływać na wrażliwość P. aeruginosa na antybiotyki, ale pełnią również inne funkcje fizjologiczne.

W genie mexS, regulatorze systemu MexEF, badacze zidentyfikowali trzy niezależne zdarzenia mutacyjne. Zmiany występowały w izolatach pochodzących ze wszystkich trzech badanych płatów.

Mutacje typu missense w systemie MexXY stwierdzano w dwóch odległych filogenetycznie klastrach. System MexXY jest istotnym mechanizmem efflux aminoglikozydów, takich jak tobramycyna.

W genach systemu MexAB autorzy wykryli natomiast siedem niezależnych zdarzeń mutacyjnych w różnych punktach czasowych, płatach i klastrach. Sześć z siedmiu zmian prowadziło do skrócenia białka i prawdopodobnej utraty jego funkcji.

Oporność fenotypową zbadano na dziewięciu izolatach

Aby sprawdzić, czy obserwowane warianty genetyczne odpowiadają rzeczywistym różnicom w odpowiedzi na antybiotyki, autorzy wybrali dziewięć izolatów: po trzy z klastrów 1, 2 i 3. Wszystkie pochodziły z górnego płata prawego płuca i zostały pobrane w pierwszym punkcie czasowym, po kursie leczenia ceftazydymem i tobramycyną.

Izolaty klastra 2 posiadały mutację nonsensowną w mexA i mutację typu missense w mexY, natomiast izolaty klastrów 1 i 3 nie miały analizowanych, niewyfixowanych mutacji w genach kodujących wielolekowe pompy efflux.

Oceniano odpowiedź na cztery antybiotyki: karbenicylinę, ceftazydym, gentamycynę i tobramycynę. Autorzy określali zarówno IC₅₀, czyli stężenie zmniejszające szybkość wzrostu hodowli w fazie logarytmicznej o połowę względem kontroli bez antybiotyku, jak i MIC definiowane w zastosowanym doświadczeniu jako stężenie utrzymujące końcową gęstość optyczną hodowli poniżej 0,1 po 20 godzinach.

Między klastrami obserwowano istotne różnice w oporności, podczas gdy pomiędzy trzema izolatami należącymi do tego samego klastra nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic dla żadnego z czterech antybiotyków.

Dla wszystkich czterech leków wartości IC₅₀ izolatów klastra 2 istotnie różniły się od wartości dla klastrów 1 i 3. Izolaty klastra 2 wykazywały niemal dziesięciokrotnie mniejszą oporność na karbenicylinę, co autorzy wiążą z mutacją nonsensowną mexA. Jednocześnie wykazywały nieco większą oporność na ceftazydym, mimo że również jest on substratem MexAB. Sugeruje to udział innych mechanizmów oporności.

Izolaty klastra 2 były ponadto mniej oporne na oba badane aminoglikozydy w porównaniu z klastrami 1 i 3. Wyniki MIC generalnie wykazywały podobny kierunek zależności, z wyjątkiem ceftazydymu, dla którego nieco większą oporność stwierdzono w klastrze 3.

Szczególnie wysokie wartości odnotowano dla tobramycyny. MIC izolatów klastrów 1, 2 i 3 wynosiły odpowiednio 62-, 45- i 74-krotność punktu odcięcia oporności CLSI. Pokazuje to znaczny stopień oporności wszystkich trzech badanych subpopulacji, mimo różnic pomiędzy nimi.

Autorzy zwracają uwagę, że mutacje systemów efflux mogą podlegać selekcji nie tylko z powodu ekspozycji na antybiotyki. Pompy te wpływają także m.in. na quorum sensing, odpowiedź na stres i wirulencję, dlatego presje selekcyjne odpowiedzialne za ich ewolucję mogą być bardziej złożone.

Znaczenie kliniczne i ograniczenia badania

Badanie dostarcza szczegółowego przykładu tego, jak złożoną strukturę może mieć przewlekła populacja Pseudomonas aeruginosa w płucach osoby z mukowiscydozą. Nie była ona jednorodną „monokulturą”, lecz dynamicznym zespołem współistniejących linii genetycznych, których względna częstość i lokalizacja zmieniały się w czasie.

Siedem spośród dziesięciu genów najczęściej opisywanych jako mutujące w 14 wcześniejszych badaniach ewolucji P. aeruginosa w płucach osób z mukowiscydozą było zmienionych również w analizowanej populacji. Były to algU, mucA, lasR, mexA, mexB, migA i pvdS. Autorzy uznają tę zgodność za kolejny argument przemawiający za powtarzalnymi, zbieżnymi kierunkami adaptacji P. aeruginosa do środowiska płuc w mukowiscydozie.

Warto zwrócić uwagę również na mutację Q45* w lasR, obecną we wszystkich izolatach. Mutacje prowadzące do utraty funkcji LasR były w innych badaniach wiązane z gorszymi wynikami klinicznymi. Mimo to u osoby analizowanej w omawianej pracy czynność płuc pozostawała względnie dobra jak na wieloletnią obecność P. aeruginosa. Autorzy podkreślają więc, że klinicznych konsekwencji określonego genotypu bakteryjnego nie można przewidywać na podstawie pojedynczej mutacji – znaczenie mają również czynniki gospodarza, szersze tło genetyczne bakterii oraz skład całej społeczności drobnoustrojów.

Najważniejsze ograniczenia

• badanie obejmowało tylko jedną osobę z mukowiscydozą;
• analizowano materiał wyłącznie z prawego płuca;
• w trzecim punkcie czasowym nie uzyskano próbki ze środkowego płata;
• kolejne BAL dostarczały przekrojowych próbek populacji w określonych momentach, a nie ciągłej obserwacji przemieszczania się bakterii;
• liczba zdarzeń migracyjnych została wywnioskowana na podstawie modeli filogenetycznych, a nie bezpośrednio zaobserwowana;
• fenotypową oporność na cztery antybiotyki oceniano w dziewięciu izolatach z trzech klastrów, nie we wszystkich 450 izolatach;
• badanie nie zostało zaprojektowane do oceny, czy testowanie większej liczby izolatów przekłada się na skuteczniejsze leczenie pacjentów.