Sekwencjonowanie DNA odsłania ukryty mikobiom dróg oddechowych w mukowiscydozie

Badacze z Seattle Children’s, we współpracy z ośrodkami akademickimi z University of Pennsylvania i University of Colorado, opisali zastosowanie metod molekularnych do wykrywania i ilościowej oceny społeczności grzybiczych w próbkach z dróg oddechowych osób z mukowiscydozą. Wyniki wskazują, że podejście oparte na analizie DNA, łączące ilościową reakcję PCR z sekwencjonowaniem nowej generacji, może ujawniać znacznie pełniejszy obraz mikobiomu niż tradycyjna hodowla. Szczególne znaczenie ma możliwość badania mniej inwazyjnych próbek, takich jak wymazy z gardła u dzieci, choć interpretacja takich wyników nadal wymaga ostrożności klinicznej.

W artykule:

• Dlaczego grzyby w drogach oddechowych osób z mukowiscydozą są trudne diagnostycznie
• Jakie próbki i metody molekularne wykorzystano w badaniu
• Czym różni się klasyczny posiew od sekwencjonowania nowej generacji
• Co oznacza wykrywanie grzybów w próbkach ujemnych w hodowli
• Jakie znaczenie mogą mieć wymazy z gardła u dzieci z mukowiscydozą
• Dlaczego wyniki nie powinny być jeszcze traktowane jako gotowy algorytm terapeutyczny

Dlaczego mikobiom dróg oddechowych w mukowiscydozie jest coraz ważniejszy

Mukowiscydoza pozostaje chorobą wielonarządową, ale to przewlekły proces zapalno-infekcyjny w układzie oddechowym przez dekady determinował rokowanie wielu pacjentów. W praktyce klinicznej najwięcej uwagi poświęcano bakteriom, zwłaszcza takim patogenom jak Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, kompleks Burkholderia cepacia czy Haemophilus influenzae. Rozwój badań mikrobiomu pokazał jednak, że drogi oddechowe chorych na mukowiscydozę nie są środowiskiem zdominowanym wyłącznie przez pojedyncze bakterie, lecz złożonym ekosystemem obejmującym bakterie, wirusy, grzyby i ich wzajemne interakcje.

Grzyby stanowią w tym układzie szczególnie trudny element. Z jednej strony ich obecność w materiale z dróg oddechowych bywa traktowana jako kolonizacja, z drugiej – niektóre gatunki mogą wiązać się z reakcją alergiczną, przewlekłym zapaleniem oskrzeli, zaostrzeniami płucnymi, pogorszeniem parametrów spirometrycznych albo istotnym ryzykiem u pacjentów po transplantacji płuc lub kwalifikowanych do przeszczepienia. Wśród klinicznie rozpoznawalnych problemów znajdują się między innymi alergiczna aspergiloza oskrzelowo-płucna, grzybicze zapalenie oskrzeli, przewlekła kolonizacja Aspergillus fumigatus, obecność drożdżaków z rodzaju Candida, a także rzadsze izolaty, takie jak Scedosporium, Lomentospora, Exophiala czy Rasamsonia.

Nie każda detekcja grzyba oznacza jednak zakażenie wymagające leczenia przeciwgrzybiczego. To jedna z najważniejszych praktycznych konsekwencji badań nad mikobiomem. Materiał biologiczny z dróg oddechowych może zawierać DNA organizmów żywych, obumarłych, przejściowo obecnych, pochodzących z mikroaspiracji treści z jamy ustnej lub gardła, a także z ekspozycji środowiskowej. Z tego powodu rozpoznanie klinicznie istotnej choroby grzybiczej wymaga łączenia wyników mikrobiologicznych z obrazem klinicznym, spirometrią, radiologią, markerami immunologicznymi, dynamiką objawów oraz odpowiedzią na leczenie.

Ograniczenia klasycznego posiewu grzybów

Klasyczny posiew jest nadal podstawową metodą diagnostyki mikrobiologicznej, ponieważ umożliwia wykazanie obecności żywego, zdolnego do wzrostu drobnoustroju. Ma także znaczenie praktyczne, gdy potrzebna jest dalsza identyfikacja izolatu, ocena fenotypu, a w wybranych sytuacjach również oznaczanie wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. Problem polega na tym, że w diagnostyce grzybów dróg oddechowych posiew może dawać obraz niepełny.

Grzyby różnią się tempem wzrostu, wymaganiami hodowlanymi i odpornością na warunki transportu oraz przechowywania próbki. Część gatunków może rosnąć powoli, część może być maskowana przez szybciej namnażające się bakterie lub drożdżaki, a część może nie zostać wykryta, jeżeli zastosowane podłoże, temperatura inkubacji lub czas obserwacji nie sprzyjają ich wzrostowi. W mukowiscydozie dodatkową trudność stanowi lepka, gęsta wydzielina, przewlekła antybiotykoterapia, okresowe stosowanie leków przeciwgrzybiczych, zmienność zaostrzeń oraz fakt, że próbki z górnych i dolnych dróg oddechowych nie muszą odzwierciedlać tego samego przedziału biologicznego.

Właśnie dlatego coraz większe znaczenie mają metody niezależne od hodowli. Nie zastępują one automatycznie posiewu, ale pozwalają zadać inne pytanie. Posiew odpowiada głównie na pytanie: „co udało się wyhodować?”. Metody molekularne odpowiadają raczej na pytanie: „jakie ślady materiału genetycznego grzybów znajdują się w próbce i jaka jest względna struktura tej społeczności?”. To fundamentalna różnica diagnostyczna i interpretacyjna.

Na czym polegało badanie opisane w Pediatric Pulmonology

Publikacja Matthew K. Foughta, Giny Hong, Alexandry C. Quinn, Brandie D. Wagner, Charlesa E. Robertsona, J. Kirka Harrisa i Theresy A. Laguna dotyczyła metod molekularnych wykrywania i ilościowej oceny społeczności grzybiczych w próbkach z dróg oddechowych w mukowiscydozie. Praca została opublikowana w czasopiśmie Pediatric Pulmonology. Z informacji Seattle Children’s wynika, że było to badanie wieloośrodkowe, prowadzone z udziałem współpracowników z Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, Colorado School of Public Health oraz Colorado School of Medicine. Analizy sekwencjonowania wykonano z wykorzystaniem Cystic Fibrosis Microbiome Analysis Core.

Badanie obejmowało próbki od dzieci z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy oraz od dorosłych pacjentów z mukowiscydozą. U dzieci równolegle pobierano płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego oraz wymazy z gardła lub okolicy ustno-gardłowej. U dorosłych analizowano odkrztuszaną plwocinę. Taki dobór materiału jest klinicznie istotny, ponieważ u małych dzieci z mukowiscydozą uzyskanie dobrej jakości plwociny bywa trudne lub niemożliwe, a bronchoskopia z płukaniem oskrzelowo-pęcherzykowym jest procedurą inwazyjną i nie nadaje się do częstego monitorowania wyłącznie z powodów badawczych.

Autorzy zastosowali podejście łączące ilościową reakcję PCR, służącą do oceny całkowitego obciążenia materiałem grzybiczym, z sekwencjonowaniem nowej generacji, które pozwala określać skład społeczności grzybiczej, względną obfitość poszczególnych taksonów, bogactwo i różnorodność. Następnie wyniki metod molekularnych zestawiono z rezultatami klasycznej hodowli grzybów.

Co daje połączenie qPCR i sekwencjonowania nowej generacji

Samo sekwencjonowanie może wskazać, jakie taksony grzybów są obecne w próbce, ale bez ilościowej oceny całkowitego obciążenia materiałem grzybiczym interpretacja bywa ograniczona. Próbka, w której jeden gatunek stanowi 80% odczytów, może oznaczać zupełnie inną sytuację biologiczną, jeśli całkowita ilość DNA grzybiczego jest wysoka, a inną, jeżeli całkowity sygnał jest bardzo niski i bliski granicy wykrywalności.

Dlatego wartość diagnostyczna podejścia opisanego przez badaczy polega nie tylko na „wykrywaniu większej liczby nazw gatunkowych”, lecz na próbie ilościowego i ekologicznego opisu mikobiomu. qPCR pozwala oszacować całkowite obciążenie grzybicze, natomiast NGS pozwala określić, które organizmy składają się na tę pulę. Z perspektywy naukowej jest to krok w stronę rozumienia mikobiomu jako dynamicznego układu biologicznego, a nie wyłącznie listy dodatnich lub ujemnych wyników posiewu.

Takie podejście może w przyszłości pomóc w odróżnianiu sytuacji, w których w próbce obecne są jedynie śladowe ilości DNA grzybów środowiskowych, od sytuacji, w których występuje wyraźne obciążenie grzybicze i dominacja taksonów potencjalnie istotnych klinicznie. Nadal jednak nie oznacza to prostego przełożenia wyniku na decyzję terapeutyczną. Wykrycie DNA nie jest równoznaczne z rozpoznaniem aktywnego zakażenia, a wynik NGS powinien być traktowany jako element większej układanki klinicznej.

Najważniejszy wniosek: hodowla może nie pokazywać pełnego obrazu

Z komunikatu Seattle Children’s wynika, że metody DNA-zależne wykrywały i identyfikowały więcej grzybów w drogach oddechowych osób z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy niż tradycyjne podejścia hodowlane. Szczególnie ważne jest to, że metoda molekularna pozwalała wykrywać grzyby także w próbkach, które w klasycznym posiewie wypadały ujemnie. Nie jest to zaskakujące z punktu widzenia biologii grzybów, ale ma istotne znaczenie praktyczne: ujemny posiew nie musi oznaczać całkowitego braku komponentu grzybiczego w drogach oddechowych.

To rozróżnienie ma duże znaczenie w mukowiscydozie, gdzie przewlekłe zmiany środowiska dróg oddechowych – gęsty śluz, zaburzony klirens śluzowo-rzęskowy, przewlekłe zapalenie neutrofilowe, antybiotykoterapia i zmieniający się skład mikrobioty bakteryjnej – mogą sprzyjać obecności złożonych społeczności mikroorganizmów. Metody molekularne mogą ujawniać komponenty tego układu, które nie są uchwytne w rutynowym posiewie.

Nie należy jednak wyciągać wniosku, że każdy dodatni wynik molekularny powinien prowadzić do leczenia przeciwgrzybiczego. Nadmierna interpretacja wyników NGS może prowadzić do niepotrzebnej farmakoterapii, ryzyka działań niepożądanych, interakcji lekowych i selekcji oporności. Znaczenie kliniczne poszczególnych sygnałów molekularnych musi być określane w badaniach prospektywnych, z powiązaniem wyników z objawami, funkcją płuc, częstością zaostrzeń, obrazem radiologicznym i długoterminowym rokowaniem.

Wymazy z gardła jako potencjalnie mniej inwazyjne okno na mikobiom

Jednym z najbardziej interesujących elementów badania jest ocena przydatności wymazów z gardła lub okolicy ustno-gardłowej. U dzieci z mukowiscydozą problem pobierania próbek jest szczególnie istotny. Odkrztuszanie plwociny może być niemożliwe, a materiał z dolnych dróg oddechowych uzyskiwany podczas bronchoskopii nie jest narzędziem do rutynowego, częstego monitorowania pacjenta ambulatoryjnego.

Jeżeli mniej inwazyjna próbka z gardła dostarcza użytecznej informacji o społecznościach grzybiczych, może to w przyszłości ułatwić badania longitudinalne, ocenę zmian mikobiomu w czasie, monitorowanie dzieci przed i po zaostrzeniach oraz analizę wpływu antybiotyków, modulatorów CFTR i leczenia przeciwgrzybiczego. Taka próbka jest łatwiejsza do pobrania, tańsza, mniej obciążająca dla pacjenta i możliwa do zastosowania w większych kohortach.

Trzeba jednak zachować ostrożność. Jama ustna i gardło mają własną mikrobiotę i mikobiotę, a wykrycie danego grzyba w wymazie z gardła nie musi oznaczać jego obecności ani aktywności w dolnych drogach oddechowych. W praktyce klinicznej wymaz z gardła może być traktowany jako potencjalny marker pośredni, ale nie jako pełny odpowiednik materiału z oskrzeli czy pęcherzyków płucnych. Znaczenie takiego badania będzie zależało od tego, czy kolejne prace potwierdzą korelacje między wynikami wymazów, próbkami z dolnych dróg oddechowych i stanem klinicznym pacjentów.

Jak wyniki wpisują się w szerszą wiedzę o grzybach w mukowiscydozie

Przeglądy literatury dotyczące mikobiomu oddechowego w mukowiscydozie wskazują, że społeczności grzybicze są zwykle mniej liczne i mniej obfite niż społeczności bakteryjne, ale mogą mieć znaczenie biologiczne. Rdzeń mikobiomu u wielu pacjentów obejmuje przede wszystkim drożdżaki, w tym Candida i Malassezia, natomiast pleśnie, takie jak Aspergillus, Scedosporium czy Exophiala, bywają mniej obfite, ale potencjalnie bardziej problematyczne klinicznie w określonych kontekstach.

Dane z badań metagenomicznych sugerują także, że wraz z progresją choroby płuc może dochodzić do zmian różnorodności mikrobiomu i mikobiomu. Obniżona różnorodność może odzwierciedlać bardziej zaawansowane, przewlekle zapalne środowisko dróg oddechowych. Z kolei zaostrzenia płucne mogą wiązać się ze zmianami składu społeczności mikroorganizmów, nie tylko bakteryjnych, ale także grzybiczych. Warto również podkreślić, że leki modulujące CFTR mogą zmieniać środowisko dróg oddechowych, a więc potencjalnie także wpływać na skład mikrobioty i mikobioty. To obszar, który będzie wymagał szczególnie uważnych badań w erze szerokiego stosowania terapii przyczynowych.

Nowe badanie nie rozstrzyga wszystkich tych pytań, ale dostarcza narzędzi do ich bardziej precyzyjnego zadawania. Jeżeli laboratorium potrafi wykrywać więcej komponentów mikobiomu i równocześnie oceniać całkowite obciążenie grzybicze, można projektować badania, które nie ograniczają się do klasycznego wyniku „wyhodowano” albo „nie wyhodowano”. Można analizować zmienność społeczności grzybiczych w czasie, wpływ terapii, relacje z bakteriami oraz związek z parametrami klinicznymi.

Znaczenie dla lekarzy i zespołów opieki nad chorymi na mukowiscydozę

Dla pulmonologów, pediatrów, mikrobiologów klinicznych, fizjoterapeutów oddechowych i zespołów opieki nad chorymi na mukowiscydozę najważniejszy przekaz jest praktyczny: wynik posiewu grzybiczego jest użyteczny, ale nie opisuje całego ekosystemu dróg oddechowych. Jeżeli pacjent ma nawracające zaostrzenia, niejednoznaczny obraz kliniczny, podejrzenie alergicznej aspergilozy oskrzelowo-płucnej, pogorszenie funkcji płuc bez jasnej przyczyny albo nietypową odpowiedź na standardowe leczenie, komponent grzybiczy powinien być brany pod uwagę w szerszej diagnostyce.

Nie oznacza to jednak, że metody NGS powinny być natychmiast stosowane rutynowo u każdego pacjenta i zastępować klasyczne procedury. Na obecnym etapie ich największa wartość leży w badaniach translacyjnych, projektach wieloośrodkowych, lepszym opisie patofizjologii oraz budowaniu przyszłych algorytmów diagnostycznych. Zanim staną się narzędziem codziennej praktyki, potrzebne są standardy pobierania próbek, ekstrakcji DNA, analizy bioinformatycznej, raportowania wyników i interpretacji klinicznej.

W przyszłości możliwy jest model zintegrowany: klasyczna hodowla pozostanie potrzebna do wykrywania żywych organizmów i dalszej charakterystyki izolatów, natomiast qPCR i NGS będą pomagały w ocenie obciążenia grzybiczego, struktury mikobiomu i zmian w czasie. Taki model mógłby szczególnie pomóc w sytuacjach, w których posiew jest ujemny, ale klinicznie utrzymuje się podejrzenie udziału grzybów w procesie chorobowym.

Dlaczego wynik molekularny nie jest jeszcze decyzją terapeutyczną

W medycynie zakażeń coraz częściej pojawia się problem nadmiaru informacji molekularnej. Im czulsza metoda, tym większa szansa wykrycia sygnału, którego znaczenie kliniczne jest niejasne. Dotyczy to zwłaszcza próbek z miejsc niesterylnych, takich jak drogi oddechowe, jama ustna czy przewód pokarmowy. W mukowiscydozie, gdzie przewlekła kolonizacja jest częścią biologii choroby, interpretacja wyników jest szczególnie wymagająca.

Dlatego konieczne jest rozróżnienie kilku poziomów znaczenia wyniku. Pierwszy poziom to wykrycie DNA grzyba. Drugi to potwierdzenie zwiększonego obciążenia grzybiczego. Trzeci to wykazanie dominacji określonego taksonu lub zmian społeczności w czasie. Czwarty to powiązanie tych zmian z objawami, zaostrzeniami, spadkiem FEV1, nasileniem stanu zapalnego lub określonym fenotypem immunologicznym. Dopiero piąty poziom może dotyczyć decyzji terapeutycznej, a i wtedy konieczna jest ocena korzyści i ryzyka leczenia.

Największym wyzwaniem będzie więc nie samo wykonanie sekwencjonowania, lecz przekształcenie wyniku w klinicznie wiarygodną informację. Lekarz potrzebuje odpowiedzi nie tylko na pytanie, czy DNA danego grzyba występuje w próbce, ale czy obecność ta zmienia rokowanie, wymaga monitorowania, sugeruje konkretny fenotyp choroby albo uzasadnia interwencję.

Co dalej w badaniach nad mikobiomem w mukowiscydozie

Autorzy i przedstawiciele Seattle Children’s wskazują, że kolejne kroki powinny dotyczyć przede wszystkim znaczenia klinicznego wykrywanych społeczności grzybiczych. Kluczowe pytania są bardzo konkretne: czy określone grzyby pogarszają przebieg choroby płuc, które taksony są neutralne, które mogą być szkodliwe, a które są jedynie markerami zmienionego środowiska dróg oddechowych? Równie ważne jest pytanie o interakcje grzybów z bakteriami, zwłaszcza w biofilmie i w czasie zaostrzeń płucnych.

Badania powinny również uwzględnić wpływ modulatorów CFTR. Poprawa transportu jonowego, nawodnienia śluzu i klirensu śluzowo-rzęskowego może zmieniać niszę ekologiczną w drogach oddechowych, a tym samym strukturę mikrobiomu i mikobiomu. W erze terapii przyczynowych klasyczne wzorce kolonizacji i zakażeń mogą ulegać przesunięciu, co wymaga nowych danych populacyjnych.

Istotnym kierunkiem będzie także walidacja wymazów z gardła jako materiału do monitorowania dzieci. Jeżeli przyszłe badania pokażą, że określone profile mikobiomu w wymazach dobrze korelują ze stanem dolnych dróg oddechowych albo z ryzykiem zaostrzeń, może to otworzyć drogę do mniej inwazyjnego nadzoru nad pacjentami pediatrycznymi. Jeżeli korelacja okaże się ograniczona, wymazy nadal mogą pozostać cennym narzędziem badawczym, ale z wyraźnie określonymi granicami interpretacji.

Wnioski dla praktyki i badań

Badanie opisane w Pediatric Pulmonology wzmacnia tezę, że grzybiczy komponent mikrobiomu dróg oddechowych w mukowiscydozie jest niedoszacowany, jeśli opieramy się wyłącznie na hodowli. Metody molekularne mogą pokazać więcej: całkowite obciążenie grzybicze, strukturę społeczności, względną dominację poszczególnych taksonów i obecność organizmów niewykrywanych w rutynowym posiewie.

Największe znaczenie tej pracy nie polega jednak na prostym stwierdzeniu, że NGS jest „czulszy” niż posiew. Znaczenie jest głębsze: badanie przesuwa diagnostykę grzybów w mukowiscydozie z myślenia o pojedynczym izolacie w stronę myślenia ekologicznego, ilościowego i longitudinalnego. To może być ważne dla przyszłych badań nad zaostrzeniami, reakcją zapalną, interakcjami bakteryjno-grzybiczymi i indywidualizacją leczenia.

Na obecnym etapie wyniki powinny być interpretowane jako istotny krok naukowy, a nie jako gotowy schemat postępowania terapeutycznego. Potrzebne są badania prospektywne, standaryzacja metod i precyzyjne określenie, które wyniki molekularne mają znaczenie kliniczne. Dopiero wtedy diagnostyka mikobiomu może realnie wejść do praktyki jako narzędzie wspierające decyzje terapeutyczne u chorych na mukowiscydozę.

Źródło: Pediatric Pulmonology, Molecular Methods to Detect and Quantify Fungal Communities in Cystic Fibrosis Airway Specimens. DOI: https://doi.org/10.1002/ppul.71598