Tranzschelia pruni-spinosae (rdza śliwy) i Phragmidium rubi-idaei (rdza maliny) indukują zapalenie i zmiany astmatyczne

Choroby alergiczne układu oddechowego – przede wszystkim astma, alergiczny nieżyt nosa i zespoły nakładające się (asthma–rhinitis overlap) – stanowią istotne obciążenie kliniczne, epidemiologiczne i ekonomiczne. W praktyce, mimo rozbudowanych paneli diagnostycznych i coraz lepszego rozumienia fenotypów/zakończonych endotypów astmy, u części pacjentów nadal nie udaje się jednoznacznie wskazać czynnika wyzwalającego lub utrzymującego zapalenie. Jedną z przyczyn jest niepełna reprezentacja aeroalergenów środowiskowych w rutynowych testach, zwłaszcza w obszarze alergenów grzybiczych.

W pracy opublikowanej w International Journal of Molecular Sciences autorzy ocenili zdolność dwóch biotroficznych grzybów rdzawych (Pucciniales), związanych z powszechnymi roślinami użytkowymi, do indukcji odpowiedzi zapalnej oraz zmian typowych dla astmy w płucach myszy. Badane gatunki to Tranzschelia pruni-spinosae (grzyb wywołujący rdzę śliwy, pozyskiwany z Prunus domestica – śliwy domowej) oraz Phragmidium rubi-idaei (grzyb wywołujący rdzę maliny / rdzę liści maliny, pozyskiwany z Rubus idaeus – maliny właściwej). Autorzy zastosowali modele ostrej i przewlekłej astmy, oceniając profil leukocytów krwi obwodowej, stężenia cytokin (IL-4, IL-5, IL-13, TNF-α, TGF-β), odpowiedź IgE swoistą oraz obraz histopatologiczny płuc.

Wyniki wskazują, że oba ekstrakty grzybowe – mimo iż słabiej indukowały IgE niż klasyczny alergen modelowy (OVA) – wywoływały wyraźną odpowiedź cytokinową z dominacją osi Th2 i istotnym sygnałem remodelingowym (TGF-β), a także zmiany histologiczne zgodne z ostrym i przewlekłym fenotypem zapalenia astmatycznego.

Autorzy i ośrodki badawcze

Badanie zostało zrealizowane przez zespół z Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, we współpracy z polskimi jednostkami zapewniającymi zaplecze zwierzętarni i patomorfologii.

Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie (UMCS), Instytut Nauk Biologicznych

• Laboratorium Badań Biomedycznych – Piotr Wlaź, Katarzyna Socała
• Katedra Wirusologii i Immunologii – Magdalena Krasowska-Kunach, Dominika Szczypior, Agnieszka Szuster-Ciesielska
• Katedra Genetyki i Mikrobiologii – Marta Palusińska-Szysz
• Katedra Botaniki, Mykologii i Ekologii – Urszula Świderska

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

• Centrum Medycyny Doświadczalnej (pochodzenie zwierząt do badań)

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

• Katedra i Zakład Patomorfologii Klinicznej (ocena histopatologiczna płuc)

Z punktu widzenia translacji do medycyny człowieka istotna jest interdyscyplinarność: mykologia i botanika (pozyskanie/identyfikacja patogenu roślinnego), immunologia (fenotyp odpowiedzi zapalnej), patomorfologia (konsekwencje narządowe w płucach).

Dlaczego „rdze roślin” mogą mieć znaczenie w alergologii i pulmonologii

Grzyby rdzawe są zwykle kojarzone z fitopatologią, ponieważ są wyspecjalizowanymi pasożytami roślin (biotrofami). W konsekwencji:

• są trudniejsze do hodowli i standaryzacji w porównaniu z typowymi grzybami środowiskowymi,
• rzadko trafiają do bibliotek alergenów wykorzystywanych w diagnostyce klinicznej,
• a ich ekspozycja bywa traktowana jako marginalna.

Jednocześnie w warunkach naturalnych rdze wytwarzają struktury zarodnikowe i fragmenty materiału biologicznego, które mogą ulegać aerozolizacji (zwłaszcza w okresach intensywnej wegetacji, prac polowych/ogrodniczych, suszy z wiatrem lub przy mechanicznym poruszaniu roślin). Z perspektywy dróg oddechowych liczy się nie tylko klasyczna alergiczność IgE-zależna, ale również zdolność do aktywacji mechanizmów wrodzonych w obrębie bariery nabłonkowej i układu fagocytarnego, co może promować fenotypy mieszane (Th2 + komponent zapalny), a w przewlekłej ekspozycji – procesy przebudowy ściany dróg oddechowych (airway remodeling).

Właśnie tę hipotezę autorzy testują doświadczalnie: czy ekstrakty z patogenów roślinnych (rdza śliwy i rdza maliny) indukują odpowiedź typową dla astmy w modelu in vivo.

Materiał biologiczny i identyfikacja gatunków

Badacze pozyskali materiał z roślin zakażonych przez rdze:

• Tranzschelia pruni-spinosae (rdza śliwy) z Prunus domestica (śliwa domowa),
• Phragmidium rubi-idaei (rdza maliny) z Rubus idaeus (malina właściwa).

Materiał został wysuszony i zdeponowany w zbiorach zielnikowych UMCS. Identyfikację oparto o ocenę morfologiczną i mikroskopową (w tym obrazowanie wysokiej rozdzielczości), a wybór gatunków uzasadniono ich powiązaniem z powszechnymi roślinami owocowymi, co zwiększa wiarygodność potencjalnej ekspozycji środowiskowej.

Z punktu widzenia medycyny istotny jest praktyczny wniosek: w odniesieniu do grzybów rdzawych częściej funkcjonują nazwy chorób roślin (np. rdza śliwy, rdza maliny) niż utrwalone „polskie nazwy gatunkowe” patogenów. Dlatego w narracji klinicznej najbardziej jednoznaczne jest zestawienie: nazwa łacińska patogenu + nazwa choroby rośliny-gospodarza po polsku.

Przygotowanie ekstraktów grzybowych

Autorzy przygotowali ekstrakty surowe (crude extracts) z materiału grzybowego, stosując procedury obejmujące:

• odtłuszczanie/oczyszczanie w acetonie,
• ekstrakcję w buforze Tris-HCl wspomaganą sonikacją,
• dializę i liofilizację,
• odtworzenie w PBS.

Stężenie białka oznaczano metodą BCA. Z perspektywy immunologicznej jest to ważne, ponieważ ekstrakt surowy stanowi mieszaninę wielu białek i składników strukturalnych. Taki bodziec może równolegle:

• indukować odpowiedź Th2 (IL-4/IL-5/IL-13),
• aktywować komponent prozapalny (np. poprzez szlaki zależne od TNF-α),
• stymulować procesy remodelingu (TGF-β),
  nawet jeśli odpowiedź IgE-swoista nie osiąga tak wysokich wartości jak w przypadku pojedynczego, silnie immunogennego alergenu modelowego.

Model doświadczalny: ostra i przewlekła astma u myszy

Zwierzęta

W badaniu wykorzystano samice myszy BALB/c (wiek 4–6 tygodni). Jest to szczep często stosowany w modelach odpowiedzi Th2, co ułatwia interpretację osi IL-4/IL-5/IL-13 w kontekście alergicznego zapalenia dróg oddechowych.

Grupy badawcze i kontrole

Utworzono grupy:

1. kontrola ujemna (PBS),
2. kontrola adiuwantowa (wodorotlenek glinu),
3. kontrola dodatnia (OVA – ovalbumina),
4. ekstrakt T. pruni-spinosae (rdza śliwy),
5. ekstrakt P. rubi-idaei (rdza maliny).

Ten układ pozwala oddzielić wpływ adiuwantu, ocenić „maksymalną” odpowiedź alergiczną w klasycznym modelu OVA i porównać ją z odpowiedzią na ekstrakty grzybowe.

Sensytyzacja i prowokacja

Schemat obejmował:

• sensytyzację dootrzewnową w dniach 0 i 14 (OVA z adiuwantem lub ekstrakty grzybowe),
• następnie prowokacje donosowe zgodnie z modelem:
  • model ostry: ekspozycje w krótkim oknie czasowym,
  • model przewlekły: powtarzane ekspozycje przez kilka tygodni.

Aplikacje donosowe wykonywano w znieczuleniu wziewnym izofluranem, co ogranicza zmienność wynikającą z zachowania zwierząt i ułatwia dostarczenie bodźca do dróg oddechowych. Materiał biologiczny pobierano 24 godziny po ostatniej ekspozycji.

Punkty końcowe i metody oceny

Autorzy oceniali trzy warstwy odpowiedzi:

1. Układowy profil komórkowy – odsetek limfocytów, granulocytów, eozynofilów i monocytów w krwi obwodowej.
2. Biomarkery zapalne i remodelingowe w surowicy – IL-4, IL-5, IL-13 (oś Th2), TNF-α (komponent prozapalny), TGF-β (remodeling).
3. Odpowiedź humoralna typu I – IgE swoiste dla OVA oraz dla białek obecnych w ekstraktach grzybowych.
4. Fenotyp narządowy – obraz histopatologiczny płuc w barwieniu H&E, ze zwróceniem uwagi na nacieki okołonaczyniowe i okołoskrzelowe, zmiany śródmiąższowe, hiperplazję nabłonka oraz cechy uszkodzenia mikrokrążenia (przekrwienie, krwawienia śródpęcherzykowe).

W analizie statystycznej stosowano testy parametryczne (jednoczynnikowa ANOVA z analizą post hoc) dla większości zmiennych oraz testy nieparametryczne (Kruskal–Wallis z porównaniami wielokrotnymi) dla IgE.

Wyniki: co wykazano w modelach ostrej i przewlekłej astmy

Leukocyty krwi obwodowej: inny „podpis” niż w modelu OVA

W grupie kontrolnej adiuwantowej odsetek limfocytów wynosił średnio:

• 85,4 ± 1,92% w modelu ostrym,
• 81,9 ± 1,96% w modelu przewlekłym.

Wyraźny spadek odsetka limfocytów obserwowano tylko w grupie OVA:

• 65,25 ± 1,75% (model ostry),
• 65,0 ± 1,85% (model przewlekły).

W przeciwieństwie do OVA, ekstrakty rdzy śliwy (T. pruni-spinosae) i rdzy maliny (P. rubi-idaei) nie powodowały istotnych zmian w odsetku limfocytów, co sugeruje odmienny rozkład odpowiedzi układowej w porównaniu z silnym, klasycznym modelem OVA.

W odniesieniu do granulocytów:

• w modelu ostrym wzrost był najbardziej wyraźny w OVA (28,5 ± 1,6%) oraz w grupie P. rubi-idaei (16,75 ± 1,39%) w porównaniu z kontrolą adiuwantową (13,0 ± 1,31%),
• po T. pruni-spinosae w modelu ostrym odsetek granulocytów był zbliżony do kontroli adiuwantowej (12,6 ± 1,77%).

W modelu przewlekłym:

• OVA zwiększał odsetek granulocytów do 32,63 ± 1,92%,
• natomiast po ekstraktach grzybowych obserwowano niewielkie, ale statystycznie istotne obniżenie względem kontroli adiuwantowej (14,38 ± 1,06%):
  • T. pruni-spinosae: 11,88 ± 1,46%,
  • P. rubi-idaei: 12,13 ± 1,55%.

Eozynofile w krwi obwodowej rosły istotnie wyłącznie w grupie OVA:

• 1,5 ± 0,54% (model ostry),
• 2,0 ± 0,76% (model przewlekły),
  w porównaniu z kontrolą adiuwantową (około 0,38%).

Interpretacyjnie ma to duże znaczenie: brak eozynofilii obwodowej po ekspozycjach grzybowych nie oznacza braku eozynofilowego komponentu zapalenia w płucach, co potwierdzała histopatologia.

Cytokiny: dominacja osi Th2 i silny sygnał remodelingowy (TGF-β)

Model ostry

W modelu ostrym obserwowano znamienne wzrosty wszystkich badanych cytokin po ekspozycji na ekstrakty grzybowe.

IL-4

• kontrola adiuwantowa: 3,88 ± 1,36 pg/mL
• OVA: 32,5 ± 2,98 pg/mL
• P. rubi-idaei (rdza maliny): 27,22 ± 1,78 pg/mL
• T. pruni-spinosae (rdza śliwy): 15,77 ± 1,71 pg/mL

IL-5

• kontrola adiuwantowa: 6,00 ± 1,31 pg/mL
• OVA: 46,25 ± 3,20 pg/mL
• T. pruni-spinosae: 30,09 ± 2,45 pg/mL
• P. rubi-idaei: 29,99 ± 2,05 pg/mL

IL-13

• kontrola adiuwantowa: 4,23 ± 1,42 pg/mL
• OVA: 27,88 ± 3,68 pg/mL
• T. pruni-spinosae: 34,87 ± 2,93 pg/mL
• P. rubi-idaei: 37,88 ± 3,68 pg/mL

W tym modelu oba ekstrakty grzybowe dawały wartości IL-13 wyższe niż OVA, co jest szczególnie istotne, ponieważ IL-13 jest centralna dla patofizjologii astmy (nadreaktywność oskrzeli, nadprodukcja śluzu, dysfunkcja nabłonka).

TNF-α

• kontrola adiuwantowa: 6,31 ± 0,66 pg/mL
• OVA: 45,25 ± 2,92 pg/mL
• T. pruni-spinosae: 37,88 ± 1,73 pg/mL
• P. rubi-idaei: 25,53 ± 2,73 pg/mL

TGF-β

• kontrola adiuwantowa: 36,04 ± 2,93 pg/mL
• OVA: 275,6 ± 3,41 pg/mL
• T. pruni-spinosae: 212,30 ± 7,13 pg/mL
• P. rubi-idaei: 183,50 ± 4,78 pg/mL

Już w ostrym modelu widać więc równoległy sygnał „alergiczny” (Th2) i „przebudowujący” (TGF-β), co wspiera hipotezę, że ekspozycja na te ekstrakty może być nie tylko wyzwalaczem objawów, ale także czynnikiem podtrzymującym przewlekłe zmiany w drogach oddechowych.

Model przewlekły

W przewlekłym modelu astmy odpowiedź cytokinowa utrzymywała się i różnicowała pomiędzy ekstraktami.

IL-4

• kontrola adiuwantowa: 4,90 ± 0,68 pg/mL
• OVA: 43,50 ± 5,73 pg/mL
• T. pruni-spinosae: 26,72 ± 2,46 pg/mL
• P. rubi-idaei: 27,10 ± 1,86 pg/mL

IL-5

• kontrola adiuwantowa: 5,23 ± 0,61 pg/mL
• OVA: 67,00 ± 3,82 pg/mL
• T. pruni-spinosae: 75,33 ± 3,14 pg/mL (najwyższa wartość spośród grup)
• P. rubi-idaei: 45,74 ± 2,88 pg/mL

Ten wynik jest klinicznie sugestywny: bardzo wysoka IL-5 w przewlekłej ekspozycji na rdzę śliwy może wskazywać na potencjał podtrzymywania eozynofilowego komponentu zapalenia w tkance, nawet jeśli eozynofile nie rosną wyraźnie w krwi obwodowej.

IL-13

• kontrola adiuwantowa: 5,43 ± 0,52 pg/mL
• OVA: 59,00 ± 4,04 pg/mL
• T. pruni-spinosae: 36,91 ± 1,49 pg/mL
• P. rubi-idaei: 27,47 ± 2,95 pg/mL

TNF-α

• kontrola adiuwantowa: 6,15 ± 0,86 pg/mL
• OVA: 38,38 ± 3,70 pg/mL
• P. rubi-idaei: 37,18 ± 1,67 pg/mL (wartości zbliżone do OVA)
• T. pruni-spinosae: 20,52 ± 2,03 pg/mL

TGF-β

• kontrola adiuwantowa: 29,75 ± 4,53 pg/mL
• OVA: 333,80 ± 16,58 pg/mL
• T. pruni-spinosae: 313,30 ± 9,38 pg/mL
• P. rubi-idaei: 258,10 ± 11,73 pg/mL

W przewlekłej ekspozycji TGF-β pozostawał bardzo wysoki, szczególnie po rdzy śliwy, co wzmacnia interpretację w kierunku istotnego potencjału remodelingowego tych ekspozycji.

IgE swoiste: obecne, ale słabsze niż w klasycznym modelu OVA

W obu modelach (ostrym i przewlekłym) wykazano istotny wzrost IgE swoistego przeciw:

• ovalbuminie (OVA),
• białkom obecnym w ekstrakcie T. pruni-spinosae (rdza śliwy),
• białkom obecnym w ekstrakcie P. rubi-idaei (rdza maliny).

Jednocześnie ekstrakty grzybowe były wyraźnie mniej skuteczne niż OVA w indukcji IgE swoistego. Taki profil jest spójny z tym, że bodźce mieszaninowe, szczególnie o złożonej strukturze biologicznej, mogą uruchamiać silny sygnał cytokinowy i tkankowy bez proporcjonalnie wysokiej odpowiedzi IgE.

Autorzy wykonali także analizę korelacji między IL-4 a IgE w rozwoju przewlekłej astmy i wykazali silne dodatnie zależności dla wszystkich trzech alergenów:

• OVA (r = 0,88),
• T. pruni-spinosae (r = 0,94),
• P. rubi-idaei (r = 0,9).

To podkreśla, że oś IL-4 pozostaje ważnym mechanizmem promującym produkcję IgE również w przypadku ekspozycji na ekstrakty grzybowe, choć poziom IgE jest niższy niż w modelu OVA.

Histopatologia płuc: obraz zapalenia okołodrożno-oddechowego i cechy progresji w przewlekłej ekspozycji

W grupach kontrolnych (PBS i adiuwant) obraz histologiczny płuc pozostawał prawidłowy zarówno w modelu ostrym, jak i przewlekłym.

W grupie OVA:

• w modelu ostrym obserwowano gęste nacieki zapalne wokół oskrzeli, naczyń i oskrzelików, z dominacją neutrofilów i eozynofilów (z domieszką limfocytów i makrofagów), ogniska zapalenia śródmiąższowego u części zwierząt, łagodną hiperplazję nabłonka oskrzelowego/oskrzelikowego oraz cechy przekrwienia i drobnych krwawień,
• w modelu przewlekłym nacieki były wieloogniskowe, ze zmianą składu komórkowego (większy udział limfocytów i plazmocytów przy utrzymaniu neutrofilów i eozynofilów), częstsze ogniska zapalenia płuc, obecność makrofagów piankowatych, lokalne skupiska limfocytów przyopłucnowo oraz – u znacznej części zwierząt – wyraźne pogrubienie ścian drobnych naczyń, co wpisuje się w obraz przewlekłej progresji.

Po ekspozycji na T. pruni-spinosae (rdza śliwy):

• w modelu ostrym zmiany przypominały grupę OVA, ale były zwykle łagodniejsze; pojedyncze zwierzę wykazywało bardziej rozległe ogniska zapalenia płuc,
• w modelu przewlekłym obraz był jakościowo podobny do OVA, z mniejszym nasileniem, i ponownie z pojedynczym przypadkiem rozleglejszego zapalenia płuc,
• w obu modelach podkreślano obecność akumulacji eozynofilów, limfocytów i granulocytów w tkance płucnej.

Po ekspozycji na P. rubi-idaei (rdza maliny):

• w modelu ostrym odpowiedź była porównywalna do OVA i T. pruni-spinosae, z wyraźnym naciekiem leukocytarnym, a u części zwierząt stwierdzano cięższe zapalenie płuc,
• w modelu przewlekłym zmiany były zbliżone co do charakteru i nasilenia do obserwowanych w grupie OVA.

Z klinicznego punktu widzenia najważniejsze jest, że oba ekstrakty wywoływały nie tylko sygnał biochemiczny (cytokiny), ale również realny fenotyp narządowy w płucach, zgodny z ostrą odpowiedzią alergiczno-zapalną oraz elementami progresji w ekspozycji przewlekłej.

Znaczenie wyników dla praktyki i badań translacyjnych

Poszerzenie spektrum podejrzewanych aeroalergenów

Standardowe podejście do alergenów grzybiczych w medycynie koncentruje się na ograniczonej grupie rodzajów. Ta praca sugeruje, że również patogeny roślinne – w tym grzyby rdzawe – mogą mieć potencjał do indukowania odpowiedzi charakterystycznej dla astmy.

W praktyce może to mieć znaczenie u pacjentów:

• z sezonowością objawów, której nie tłumaczą klasyczne panele alergenowe,
• z nasileniem dolegliwości w okresach prac ogrodniczych lub w środowisku upraw,
• z fenotypami astmy, w których dominuje komponent zapalny i przebudowa dróg oddechowych.

IgE nie jest jedynym „językiem” ekspozycji grzybowej

Słabsza indukcja IgE przy jednocześnie silnej odpowiedzi cytokinowej i histologicznej jest spójna z koncepcją, że część ekspozycji grzybowych może działać poprzez:

• mechanizmy mieszane (Th2 + wrodzona aktywacja bariery),
• komponenty prozapalne i remodelingu,
  co klinicznie może odpowiadać pacjentom z trudną kontrolą, niejednoznacznymi testami alergologicznymi i obrazem przewlekłego zapalenia.

Sygnał TGF-β jako most do remodelingu

Bardzo wysokie stężenia TGF-β w modelu przewlekłym (szczególnie po rdzy śliwy) sugerują, że przewlekła ekspozycja na takie bodźce może sprzyjać procesom przebudowy w drogach oddechowych. W praktyce oznacza to potencjalny związek z:

• utrwalaniem obturacji,
• zmianą odpowiedzi na leczenie przeciwzapalne,
• większą rolą strategii ograniczania ekspozycji środowiskowej w wybranych populacjach.

Ograniczenia i kierunki dalszych badań

Badanie ma wysoki walor demonstracyjny, ale jego bezpośrednie przełożenie na diagnostykę człowieka wymaga kolejnych etapów:

• Ekstrakty surowe wymagają dalszej standaryzacji i identyfikacji dominujących komponentów immunogennych (białka, epitopy, glikozylacje), aby można było opracować wiarygodne testy serologiczne lub komponentowe.
• Ocena cytokin w surowicy opisuje komponent układowy; potrzebne są równoległe pomiary lokalne w drogach oddechowych (np. w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych) oraz ocena funkcji płuc w modelach zwierzęcych.
• Schemat sensytyzacji dootrzewnowej ułatwia indukcję odpowiedzi, ale nie odzwierciedla w pełni naturalnej drogi narażenia środowiskowego; wartościowe byłyby modele sensytyzacji drogą oddechową bez udziału adiuwantu lub z adiuwantami środowiskowymi.
• Histopatologia ma charakter opisowy; dalsze prace mogłyby wzmocnić wnioskowanie poprzez morfometrię, półilościowe skale zaawansowania zmian oraz markery immunohistochemiczne.

Mimo tych ograniczeń praca wyraźnie wskazuje, że rdze roślin nie powinny być automatycznie wykluczane jako potencjalne źródło bodźców proastmatycznych w środowisku.

1. Ekstrakty Tranzschelia pruni-spinosae (rdza śliwy) i Phragmidium rubi-idaei (rdza maliny) indukują w modelach mysich zarówno ostrą, jak i przewlekłą odpowiedź zgodną z zapaleniem astmatycznym, obejmującą wzrost cytokin osi Th2, wzrost TNF-α oraz bardzo silny sygnał TGF-β.
2. Odpowiedź IgE swoista jest obecna, lecz słabsza niż w klasycznym modelu OVA, co wspiera koncepcję mechanizmów mieszanych i potencjalnego udziału aktywacji wrodzonej oraz procesów remodelingowych.
3. Z punktu widzenia medycyny środowiskowej i alergologii wyniki uzasadniają poszerzanie perspektywy na „nietypowe” aeroalergeny grzybicze, zwłaszcza w kontekście ekspozycji na środowiska sadownicze i ogrodnicze.

Źródło: International Journal of Molecular Sciences, Plant Microfungi Tranzschelia pruni-spinosae and Phragmidium rubi-idaei Demonstrate Allergenic Capabilities in Mouse Models of Asthma
DOI: https://doi.org/10.3390/ijms27031507