Bardziej zjadliwe szczepy Pseudomonas aeruginosa silniej destabilizują biofilm wielogatunkowy

Zdolność Pseudomonas aeruginosa do dominowania w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych może być powiązana z częścią mechanizmów, które uczestniczą również w jej zjadliwości. W badaniu in vitro opublikowanym w FEMS Microbiology Letters szczep PA14, klasyfikowany w dotychczasowych modelach jako wysoce zjadliwy, znacznie silniej niż umiarkowanie zjadliwy PAO1 zmniejszał biomasę modelowego biofilmu THOR i ograniczał liczebność niektórych tworzących go bakterii. Wyniki pomagają lepiej zrozumieć ekologiczną przewagę P. aeruginosa, ale nie stanowią bezpośredniego modelu zakażenia płuc ani dowodu klinicznego dotyczącego osób z mukowiscydozą.

Pseudomonas aeruginosa jako patogen i konkurent ekologiczny

Pseudomonas aeruginosa jest Gram-ujemną bakterią oportunistyczną, która może wywoływać zakażenia płuc, krwi, układu moczowego, wsierdzia oraz ran. Szczególne znaczenie kliniczne ma u pacjentów hospitalizowanych, osób z zaburzeniami odporności oraz chorych na mukowiscydozę, u których może prowadzić do przewlekłego zakażenia oskrzelowo-płucnego.

W drogach oddechowych osób z mukowiscydozą bakteria ta nie funkcjonuje jednak w izolacji. Musi współistnieć lub konkurować z innymi mikroorganizmami, które zajmują te same nisze, wykorzystują podobne składniki odżywcze i uczestniczą w tworzeniu wielogatunkowych struktur biofilmowych.

Uzyskanie dominującej pozycji wymaga zatem nie tylko odporności na mechanizmy obronne gospodarza i leczenie przeciwdrobnoustrojowe, ale również zdolności do wypierania sąsiednich bakterii. P. aeruginosa może wykorzystywać w tym celu między innymi toksyny, enzymy, metabolity wtórne, związki o aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz systemy sekrecji pozwalające na bezpośrednie oddziaływanie na inne komórki.

Tworzenie biofilmu sprzyja utrzymywaniu się P. aeruginosa w przewlekłych zakażeniach. Nie oznacza to jednak, że większa ilość biofilmu zawsze odpowiada większej liczbie żywych bakterii. Biomasa biofilmu obejmuje zarówno komórki, jak i macierz zewnątrzkomórkową, podczas gdy liczba jednostek tworzących kolonie – CFU – odzwierciedla komórki zdolne do wzrostu na podłożu hodowlanym.

Zjadliwość nie ogranicza się do uszkadzania gospodarza

Czynniki określane jako czynniki zjadliwości analizuje się zazwyczaj w kontekście ich wpływu na komórki gospodarza, odpowiedź immunologiczną i uszkodzenie tkanek. Część tych samych mechanizmów może jednak wpływać na bakterie zasiedlające to samo środowisko.

Enzymy degradacyjne mogą zmieniać macierz biofilmu, metabolity wtórne mogą hamować wzrost konkurentów, a systemy sekrecji mogą dostarczać toksyczne efektory bezpośrednio do sąsiednich komórek. Z punktu widzenia ekologii mikroorganizmów mechanizm zwiększający zjadliwość może więc równocześnie zwiększać zdolność do konkurowania o przestrzeń i zasoby.

Autorzy, ośrodki badawcze i pytanie naukowe

Autorami pracy byli Emil Burman, Mikkel Anbo, Lars Jelsbak oraz Johan Bengtsson-Palme. Autorem korespondencyjnym był Johan Bengtsson-Palme.

W badaniu uczestniczyły zespoły związane z następującymi ośrodkami:

• Division of Systems and Synthetic Biology, Department of Life Sciences, SciLifeLab, Chalmers University of Technology w Göteborgu,
• Department of Infectious Diseases, Institute of Biomedicine, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg,
• Centre for Antibiotic Resistance Research (CARe) in Gothenburg,
• Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark w Kongens Lyngby.

Praca została opublikowana w czasopiśmie FEMS Microbiology Letters. Udostępniony dokument jest wersją „Original Unedited Manuscript”, czyli zaakceptowanym, ale jeszcze niepoddanym końcowej redakcji wydawniczej manuskryptem.

Autorzy chcieli ustalić, czy zdolność P. aeruginosa do zajmowania i destabilizowania istniejącej społeczności mikrobiologicznej jest związana z profilem zjadliwości szczepu. Porównali szczep PAO1, określany jako umiarkowanie zjadliwy, ze szczepem PA14, który w licznych wcześniejszych modelach wykazywał wysoce zjadliwy lub hiperwirulentny fenotyp.

Hipoteza zakładała, że wprowadzenie P. aeruginosa zmniejszy biomasę ustabilizowanego biofilmu, a szczep o silniejszym profilu zjadliwości wywoła większe zaburzenia niż szczep mniej zjadliwy.

THOR – kontrolowany model społeczności bakteryjnej

THOR nie jest modelem mikrobiomu ludzkich dróg oddechowych i nie zawiera bakterii wyizolowanych z płuc. Jego wartość eksperymentalna wynika z dokładnie zdefiniowanego składu oraz poznanych zależności między poszczególnymi członkami społeczności.

W obrębie THOR występują zarówno interakcje sprzyjające wzrostowi, jak i antagonizm. F. johnsoniae uczestniczy w procesach wspierających wzrost B. cereus w środowisku ubogim w składniki odżywcze. P. koreensis wytwarza natomiast koreenceinę – alkaloidowy antybiotyk ograniczający wzrost F. johnsoniae. Działanie to może być neutralizowane przez B. cereus za pośrednictwem mechanizmu związanego z klastrem genowym spo0H.

Społeczność tworzy biofilm, wykorzystuje wzajemne zasilanie metaboliczne, podział nisz oraz mechanizmy antagonizmu. Są to ogólne zasady ekologiczne występujące również w społecznościach związanych z człowiekiem, chociaż konkretne gatunki i warunki środowiskowe są odmienne.

Dlaczego zastosowano uproszczony model

Naturalny mikrobiom składa się z wielu gatunków, zmienia się w czasie i pozostaje pod wpływem gospodarza, leków, dostępności tlenu oraz składników odżywczych. Taka złożoność utrudnia przypisanie obserwowanej zmiany konkretnemu mechanizmowi.

W modelu THOR każdy członek społeczności jest znany, można go oddzielnie policzyć, a warunki hodowli można powtarzać. Pozwala to obserwować, czy wprowadzenie nowego gatunku zmienia całkowitą biomasę biofilmu, liczebność poszczególnych bakterii lub równowagę między nimi.

Przebieg doświadczenia

Badacze przygotowali wspólną hodowlę P. koreensis, F. johnsoniae i B. cereus w płytkach 96-dołkowych. Społeczność inkubowano przez 15 godzin w temperaturze 18°C, aby umożliwić wstępne ustabilizowanie biofilmu.

Następnie do dołków dodawano określone szczepy P. aeruginosa i prowadzono dalszą hodowlę przez 24 godziny. Cały zasadniczy eksperyment obejmował więc 15 godzin tworzenia społeczności przed inwazją oraz 24 godziny po wprowadzeniu patogenu.

Główne porównanie obejmowało:

• społeczność THOR bez wprowadzenia P. aeruginosa,
• THOR po wprowadzeniu szczepu PAO1,
• THOR po wprowadzeniu szczepu PA14.

W kolejnych analizach wykorzystano także szczep PAO1ΔOSA pozbawiony chromosomalnego antygenu O, wariant mPAO1 oraz dwa izolaty kliniczne.

Dwie różne metody oceny biofilmu

Całkowitą biomasę biofilmu oceniano za pomocą barwienia fioletem krystalicznym. Po wypłukaniu niezwiązanych komórek biofilm barwiono 0,1-procentowym roztworem fioletu krystalicznego, a następnie uwalniano barwnik przy użyciu 33-procentowego kwasu octowego. Absorbancję mierzono przy długości fali 595 nm.

Metoda ta informuje o ilości materiału pozostającego na powierzchni dołka. Obejmuje komórki bakteryjne oraz elementy macierzy biofilmu, ale nie rozróżnia komórek żywych, martwych i niezdolnych do wzrostu.

Liczebność poszczególnych gatunków oceniano natomiast poprzez seryjne rozcieńczenia i wysiew na podłoża selektywne. Wyniki podawano jako CFU, czyli liczbę jednostek tworzących kolonie.

PA14 znacznie silniej zmniejszał biomasę biofilmu

Wprowadzenie PAO1 do ustabilizowanej społeczności THOR prowadziło do wyraźnego zmniejszenia całkowitej biomasy biofilmu w porównaniu z biofilmem bez P. aeruginosa.

W tekście wyników autorzy podali dla tego porównania wartość p < 10⁻⁷. W podpisie ryciny 1 zastosowano natomiast oznaczenie odpowiadające wartości p < 10⁻⁶. Niezależnie od tej niespójności oba zapisy wskazują na bardzo silną istotność statystyczną obserwowanego spadku.

Po wprowadzeniu PA14 biomasa zmniejszała się jeszcze bardziej. Różnica między PA14 a PAO1 była statystycznie istotna przy wartości p < 0,001.

Na rycinie 1 średnia absorbancja biofilmu bez inwazji wynosiła w przybliżeniu 0,75. Po zastosowaniu PAO1 spadała do około 0,37, a po zastosowaniu PA14 do około 0,20. Są to wartości odczytywane orientacyjnie z wykresu, ponieważ autorzy nie przedstawili w tekście dokładnych średnich ani przedziałów ufności.

Wartość uzyskana po zastosowaniu PA14 znajdowała się niewiele powyżej zaznaczonej na wykresie granicy detekcji. W dyskusji autorzy wskazali, że absorbancja zbliżała się do wartości obserwowanych w pustych dołkach, co interpretowali jako oznakę rozległego uszkodzenia lub utraty struktury biofilmu.

PAO1 zmniejszał biomasę bez istotnego spadku liczby CFU

Wynik dotyczący PAO1 pokazuje, dlaczego biomasy biofilmu nie należy utożsamiać bezpośrednio z liczbą żywych bakterii. Mimo znacznego spadku absorbancji autorzy nie stwierdzili statystycznie istotnych zmian liczby CFU P. koreensis, F. johnsoniae ani B. cereus.

Może to oznaczać, że PAO1 wpływał przede wszystkim na architekturę biofilmu, ilość macierzy zewnątrzkomórkowej, przyleganie komórek lub ich rozmieszczenie na powierzchni. Część bakterii mogła pozostawać żywa i zdolna do wzrostu na podłożu, mimo że mniejsza ilość materiału pozostawała przytwierdzona do dołka.

Nie można jednak wskazać jednego mechanizmu na podstawie samego barwienia i CFU. W badaniu nie zastosowano obrazowania mikroskopowego struktury biofilmu, pomiaru składników macierzy ani analizy ekspresji genów odpowiedzialnych za adhezję i rozpraszanie biofilmu.

PA14 silnie ograniczał Pseudomonas koreensis i Flavobacterium johnsoniae

Po wprowadzeniu PA14 obserwowano nie tylko utratę biomasy, ale również znaczne zmniejszenie liczby CFU dwóch członków społeczności THOR.

Liczebność P. koreensis zmniejszyła się z 5,6 × 10⁶ CFU/ml do 9,5 × 10⁴ CFU/ml. Odpowiada to około 59-krotnemu spadkowi, czyli redukcji o około 1,77 log₁₀.

Liczebność F. johnsoniae zmniejszyła się z 7,8 × 10⁴ CFU/ml do 9,82 × 10² CFU/ml. Jest to około 79-krotny spadek, odpowiadający redukcji o około 1,90 log₁₀.

W przypadku B. cereus liczba CFU zmniejszyła się z około 1,1 × 10³ do 8,2 × 10², czyli jedynie około 1,3-krotnie. Różnica ta nie była statystycznie istotna.

PA14 nie wygrywał przez proste zwiększenie własnej liczebności

Ważnym elementem interpretacji jest zachowanie samego P. aeruginosa. Po wprowadzeniu PA14 liczba CFU tego szczepu była niższa niż liczba CFU PAO1 w odpowiadającym eksperymencie.

Oznacza to, że wynik nie odpowiada prostemu scenariuszowi, w którym PA14 intensywnie namnaża się, zajmuje całą dostępną przestrzeń i wypiera pozostałe bakterie wyłącznie dzięki większej liczebności.

Bardziej prawdopodobna jest rozległa destabilizacja całej struktury biofilmu. Jeżeli PA14 ograniczał ilość macierzy i powierzchni dostępnej dla komórek, konsekwencje mogły dotyczyć zarówno członków THOR, jak i samego inwadera.

Autorzy określają to jako silną konkurencyjną ekskluzję rezydentów. Jednocześnie obniżona liczebność PA14 wskazuje, że efekt mógł obejmować szersze zniszczenie środowiska biofilmowego, a nie wyłącznie zastąpienie jednej społeczności przez drugą.

Kontrola z użyciem mPAO1

Autorzy wykonali także doświadczenie z PAO1 typu dzikiego i porównali je z wariantem mPAO1. Nie stwierdzili istotnej różnicy w liczbie kolonii między tymi wariantami. Wynik ten przedstawiono w materiale uzupełniającym.

Dlaczego PA14 mógł wywoływać silniejsze zaburzenia

PAO1 i PA14 są powszechnie stosowanymi szczepami referencyjnymi, ale nie różnią się wyłącznie jednym genem. Posiadają odmienne zestawy genów dodatkowych, różnice regulacyjne i różne profile ekspresji czynników zjadliwości.

PA14 zawiera między innymi wyspy patogenności PAPI-1 i PAPI-2, które są nieobecne lub jedynie częściowo reprezentowane w PAO1. Wyspy te kodują dodatkowe elementy mogące zwiększać potencjał chorobotwórczy bakterii.

Jedna z ważnych różnic dotyczy systemu sekrecji typu III, T3SS. PAO1 wytwarza efektory ExoS, ExoT i ExoY, natomiast PA14 zawiera silnie cytotoksyczną fosfolipazę ExoU zamiast ExoS. ExoU jest związana z szybkim uszkadzaniem błon komórek gospodarza i ich lizą.

Nie oznacza to jednak, że to właśnie ExoU odpowiadała za zniszczenie społeczności THOR. Nie badano szczepu PA14 pozbawionego exoU ani nie porównywano wariantów różniących się wyłącznie tym genem.

PAO1 i PA14 różnią się również regulacją quorum sensing, wykorzystywaniem egzopolisacharydów, produkcją surfaktantów i zachowaniem podczas wzrostu na powierzchni. Każda z tych różnic mogła potencjalnie wpływać na powstawanie, stabilność albo rozpraszanie biofilmu.

System sekrecji typu VI jako broń przeciw innym bakteriom

W bezpośredniej konkurencji między bakteriami szczególne znaczenie ma system sekrecji typu VI, T6SS. Jest to złożony aparat molekularny umożliwiający kontaktowe wprowadzanie efektorów do sąsiedniej komórki.

Niektóre efektory T6SS uszkadzają błonę, ścianę komórkową lub materiał genetyczny konkurenta. System ten bywa porównywany do odwróconej kurczliwej struktury przypominającej ogon bakteriofaga.

Autorzy omawiają T6SS jako prawdopodobnego uczestnika konkurencji, ale jego aktywności nie mierzono bezpośrednio. Nie można zatem stwierdzić, że różnica między PA14 a PAO1 wynikała właśnie z działania tego systemu.

Utrata antygenu O zmieniała relacje wewnątrz społeczności

Autorzy analizowali także PAO1ΔOSA – genetycznie zmodyfikowany wariant, w którym usunięto chromosomalny antygen O swoisty dla danego szczepu.

Antygen O jest najbardziej zewnętrzną częścią lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych. Wpływa na właściwości powierzchni komórki, jej oddziaływanie ze środowiskiem, adhezję, stabilność błony zewnętrznej oraz podatność na mechanizmy odporności gospodarza.

Podczas przewlekłego zakażenia dróg oddechowych P. aeruginosa może zmieniać lub tracić niektóre struktury powierzchniowe. Taka adaptacja może ograniczać rozpoznawanie przez układ odpornościowy, lecz równocześnie wpływać na przyleganie i tworzenie biofilmu.

Duży defekt w monokulturze, mniejszy problem w gotowym biofilmie

W jednogatunkowym biofilmie PAO1ΔOSA osiągał około 100-krotnie mniejszą liczbę CFU niż szczep typu dzikiego. Wynik wskazuje na poważne upośledzenie samodzielnego zasiedlania powierzchni albo utrzymywania się w biofilmie.

Po wprowadzeniu do wcześniej utworzonego biofilmu THOR liczebność PAO1ΔOSA była jednak zbliżona do liczebności PAO1. Różnica między jego słabym wzrostem w monokulturze a stosunkowo dobrym utrzymywaniem się w społeczności sugeruje, że wariant mógł korzystać ze struktury wytworzonej przez inne bakterie.

Komórki pozbawione antygenu O mogły osadzać się w istniejącej macierzy zewnątrzkomórkowej, uzyskując dostęp do składników odżywczych i ochrony bez konieczności samodzielnego budowania całej infrastruktury biofilmu.

Autorzy opisują ten potencjalny mechanizm jako ekologiczne „podczepianie się” do gotowej struktury. Jest to jednak interpretacja, której nie potwierdzono bezpośrednim obrazowaniem lokalizacji komórek PAO1ΔOSA w macierzy THOR.

Więcej Bacillus cereus po wprowadzeniu PAO1ΔOSA

W społeczności zaatakowanej przez PAO1ΔOSA liczba B. cereus była istotnie większa niż w społeczności z PAO1 typu dzikiego. Wartość p dla tego porównania wynosiła mniej niż 0,01.

Niewielkie wzrosty liczebności obserwowano także w przypadku P. koreensis i F. johnsoniae. Autorzy interpretują te wyniki jako sygnał, że antygen O wpływa na dynamikę konkurencji i podział nisz wewnątrz społeczności.

Utrata antygenu O może osłabiać adhezję, zmieniać kontakt między komórkami oraz wpływać na skuteczność systemów sekrecji. Możliwe jest zarówno gorsze wykorzystywanie własnego T6SS, jak i większa podatność na atak ze strony innych bakterii. Żaden z tych mechanizmów nie został jednak bezpośrednio zmierzony.

Izolaty kliniczne nie zachowywały się jednakowo

Aby rozszerzyć obserwacje poza laboratoryjne szczepy referencyjne i wariant genetycznie zmodyfikowany, autorzy wykorzystali dwa izolaty kliniczne P. aeruginosa.

Pierwszy, CCUG71613, pochodził od zaintubowanego pacjenta z przewlekłym zapaleniem płuc. Drugi, oznaczony w wynikach jako CCUG73475, pochodził z bakteriemii u pacjenta z sepsą.

Izolat z przewlekłego zapalenia płuc powodował niewielkie zaburzenia

Po wprowadzeniu CCUG71613 liczebność P. koreensis, F. johnsoniae i B. cereus pozostawała na poziomie zbliżonym do obserwowanego po wprowadzeniu PAO1.

Istotnie mniejsza była natomiast liczba CFU samego izolatu CCUG71613 w porównaniu z PAO1. Oznacza to, że izolat pochodzący z przewlekłego zakażenia płuc nie wykazywał w tym modelu szczególnie silnej zdolności do ekspansji ani destabilizowania społeczności.

Autorzy wiążą ten wynik z możliwością adaptacji do przewlekłego zakażenia. Szczepy utrzymujące się przez długi czas w drogach oddechowych mogą tracić część mechanizmów związanych z ostrą zjadliwością, jednocześnie rozwijając cechy sprzyjające trwałej kolonizacji i przetrwaniu.

Jest to jednak interpretacja odnosząca się do jednego izolatu. Na tej podstawie nie można stwierdzić, że wszystkie szczepy pochodzące z przewlekłego zakażenia płuc będą słabszymi konkurentami.

Izolat związany z sepsą silniej ograniczał członków THOR

Wprowadzenie izolatu CCUG73475 prowadziło do zmniejszenia liczby CFU wszystkich trzech członków społeczności THOR. Jednocześnie liczebność samego izolatu pozostawała zbliżona do liczebności PAO1.

Profil ten przypominał strategię szczepu skuteczniej destabilizującego społeczność. Autorzy sugerują, że cechy wyselekcjonowane podczas ciężkiego zakażenia inwazyjnego mogą również zwiększać konkurencyjność wobec innych mikroorganizmów.

Także w tym przypadku nie można rozdzielić wpływu miejsca pochodzenia izolatu od jego indywidualnego tła genetycznego. Badano tylko jeden izolat pochodzący z sepsy i jeden z przewlekłego zapalenia płuc.

Możliwa współselekcja konkurencyjności i zjadliwości

Autorzy proponują model, w którym mechanizmy korzystne podczas konkurencji międzygatunkowej mogą być wybierane równolegle z mechanizmami zwiększającymi zjadliwość wobec gospodarza.

Szczep zdolny do skutecznego hamowania innych bakterii uzyskuje większy dostęp do przestrzeni i zasobów. Jeżeli wykorzystywane w tym celu toksyny, enzymy lub systemy sekrecji uszkadzają również komórki gospodarza, presja selekcyjna sprzyjająca konkurencyjności może pośrednio promować większą zjadliwość.

Możliwy jest również proces odwrotny. Cechy wyselekcjonowane dlatego, że pomagają przełamywać bariery gospodarza lub powodować zakażenie inwazyjne, mogą przypadkowo zwiększać zdolność do wypierania innych mikroorganizmów.

Autorzy określają to jako potencjalne sprzężenie zwrotne między konkurencją międzygatunkową a zjadliwością. Badanie nie analizowało jednak ewolucji szczepów w czasie, dlatego współselekcja pozostaje hipotezą wynikającą z obserwowanego podobieństwa funkcji, a nie bezpośrednio wykazanym procesem ewolucyjnym.

Znaczenie dla zakażeń dróg oddechowych i mukowiscydozy

U osób z mukowiscydozą przewlekłe zakażenie P. aeruginosa może współwystępować ze stopniowym upraszczaniem składu mikrobiomu dróg oddechowych oraz uzyskiwaniem przez ten patogen pozycji dominującej.

Wcześniejsze badania cytowane przez autorów wskazują, że przewlekłe, a nie jedynie okresowe wykrywanie P. aeruginosa wiąże się z szerszymi zmianami mikrobiomu płuc. Zmiany dominacji mikrobiologicznej obserwowano również równolegle z pogorszeniem czynności płuc i wahaniami nasilenia zapalenia.

Nowe badanie dostarcza mechanistycznej hipotezy, która może częściowo tłumaczyć takie obserwacje. Niektóre szczepy P. aeruginosa mogą dysponować mechanizmami pozwalającymi im skuteczniej zaburzać istniejące społeczności, a nie tylko biernie wykorzystywać warunki sprzyjające wzrostowi.

Nie wykazano jednak, że proces obserwowany w THOR zachodzi w taki sam sposób w drogach oddechowych. Model nie obejmował śluzu, komórek nabłonkowych, neutrofili, przeciwciał, peptydów przeciwdrobnoustrojowych, gradientów tlenu ani ekspozycji na antybiotyki.

Nie uwzględniał również mutacji adaptacyjnych, które mogą narastać podczas wieloletniego zakażenia płuc, ani interakcji z typowymi składnikami mikrobiomu dróg oddechowych.

Najważniejsze mocne strony badania

Zastosowanie zdefiniowanej społeczności umożliwiło rozdzielenie wpływu na biomasę całego biofilmu od wpływu na poszczególne gatunki. Było to istotne, ponieważ wynik PAO1 pokazał, że oba parametry mogą zmieniać się niezależnie.

Badacze nie ograniczyli się do jednego szczepu. Porównali dwa szczepy referencyjne o odmiennym profilu, wariant pozbawiony antygenu O oraz dwa izolaty kliniczne. Pozwoliło to pokazać, że zachowanie P. aeruginosa jest silnie zależne od konkretnego szczepu.

Dodatkową zaletą było wprowadzenie patogenu do wcześniej formującej się społeczności zamiast jednoczesnego rozpoczynania hodowli wszystkich bakterii. Taki układ lepiej odpowiada pytaniu o inwazję istniejącego ekosystemu.

Ograniczenia metodologiczne wymagają ostrożnej interpretacji

Mała liczba replik

W pomiarze biomasy wykorzystano pięć replik biologicznych, z których każda była średnią z ośmiu replik technicznych. W analizie CFU przedstawionej na rycinie 2 wykorzystano trzy repliki biologiczne.

Repliki techniczne zwiększają precyzję pomiaru tej samej próbki, ale nie zastępują niezależnych replik biologicznych. Przy trzech replikach trudno wiarygodnie ocenić rozkład danych, odporność wyniku na wartości odstające oraz rzeczywistą zmienność biologiczną.

Liczne porównania statystyczne

Autorzy stosowali testy t-Studenta w wielu porównaniach między szczepami i gatunkami. W udostępnionym tekście nie opisano korekty poziomu istotności związanej z wykonywaniem licznych testów.

Nie oznacza to, że obserwowane różnice są nieprawdziwe, zwłaszcza gdy wielkość efektu była bardzo duża. Ogranicza jednak pewność interpretacji słabszych różnic i zwiększa znaczenie potwierdzenia wyników w większej liczbie niezależnych eksperymentów.

Brak bezpośredniego pomiaru mechanizmów

W pracy nie mierzono produkcji toksyn, aktywności T3SS lub T6SS, ekspresji genów quorum sensing ani składu macierzy biofilmu. Nie zastosowano także obrazowania pokazującego przestrzenne rozmieszczenie poszczególnych bakterii.

Badanie bardzo dobrze dokumentuje różnicę fenotypową, ale wyjaśnienie molekularne pozostaje otwarte.

Krótki czas działania modelu

THOR nie może utrzymywać ciągłego wzrostu przez okres dłuższy niż około 48 godzin z powodu wyczerpywania składników odżywczych. Model nie pozwala zatem obserwować tygodniowych lub wielomiesięcznych procesów adaptacyjnych typowych dla przewlekłych zakażeń.

Systemy przepływowe mogą umożliwiać dłuższą obserwację społeczności związanych z mukowiscydozą, ale również nie odtwarzają wszystkich elementów odpowiedzi gospodarza.

Wnioski

Badanie pokazuje, że wpływ Pseudomonas aeruginosa na istniejącą społeczność biofilmową jest silnie zależny od szczepu. PAO1 wyraźnie zmniejszał całkowitą biomasę, ale nie powodował istotnego spadku liczebności trzech członków THOR. PA14 prowadził natomiast do głębszego zaniku biomasy i kilkudziesięciokrotnego ograniczenia liczby P. koreensis oraz F. johnsoniae.

Niższa liczebność samego PA14 w porównaniu z PAO1 wskazuje, że efekt nie polegał wyłącznie na nadmiernym wzroście inwadera. Bardziej prawdopodobna była szeroka destabilizacja struktury biofilmu, zmniejszająca przestrzeń dostępną dla większości bakterii.

Wyniki dotyczące PAO1ΔOSA pokazują, że struktury powierzchniowe mogą odmiennie wpływać na samodzielne tworzenie biofilmu i na zdolność do wykorzystania biofilmu utworzonego wcześniej przez inne gatunki.

Różnice między izolatami klinicznymi wskazują natomiast, że ekologicznego zachowania P. aeruginosa nie można przewidywać wyłącznie na podstawie nazwy gatunku. Istotne są indywidualne cechy szczepu, jego historia ewolucyjna i kontekst, w którym został wyizolowany.

Praca wspiera hipotezę, że część mechanizmów związanych ze zjadliwością może jednocześnie zwiększać konkurencyjność międzybakteryjną. Nie dowodzi jednak bezpośrednio, że większa zjadliwość powoduje silniejszą destabilizację mikrobiomu człowieka.

Źródło: FEMS Microbiology Letters, Virulent strains of Pseudomonas aeruginosa are more disruptive during invasion of a microbial model community.
DOI: https://doi.org/10.1093/femsle/fnag090