Mukowiscydoza może zmieniać skład komórkowy płuc jeszcze przed narodzinami

Analiza transkryptomiczna pojedynczych komórek płuc owiec pozwoliła prześledzić późne etapy rozwoju układu oddechowego, które u człowieka są wyjątkowo trudne do badania. Naukowcy wykazali również, że utrata funkcji CFTR wiąże się ze zmianami składu komórkowego płuca jeszcze przed urodzeniem. Najbardziej widoczne różnice dotyczyły populacji komórek nabłonkowych, śródbłonkowych i odpornościowych, w tym nadmiernej reprezentacji komórek rzęskowych w płucach owiec z mukowiscydozą pod koniec ciąży.

Dlaczego owca jest modelem rozwoju ludzkich płuc

Wiele procesów zachodzących w późnym okresie życia płodowego człowieka pozostaje niedostępnych bezpośrednim badaniom. Wiedza dotycząca dojrzewania narządów, w tym układu oddechowego, musi więc częściowo opierać się na analizie innych ssaków. Jednym z najważniejszych modeli dużych zwierząt wykorzystywanych w takich badaniach jest owca domowa, Ovis aries.

Rozwój płuc owcy pod wieloma względami przypomina rozwój płuc człowieka. Podobieństwa obejmują budowę narządu, jego wielkość, fizjologię, przebieg dojrzewania układu oddechowego oraz relatywnie długi okres ciąży. Ciąża u owcy trwa około 147 dni, co umożliwia pobieranie materiału na ściśle określonych etapach rozwoju i analizowanie procesów trudnych do odtworzenia w modelach gryzoni.

Model owczy jest szczególnie cenny przy badaniu chorób, których początki mogą sięgać okresu prenatalnego. Do takich chorób należy mukowiscydoza, wielonarządowa choroba genetyczna spowodowana patogennymi wariantami genu CFTR. Wcześniej opracowano owce z utratą funkcji CFTR, u których występuje wiele cech przypominających mukowiscydozę człowieka.

Rozwój ludzkiego płuca dzieli się zwykle na pięć częściowo nakładających się etapów: embrionalny, rzekomogruczołowy, kanalikowy, woreczkowy i pęcherzykowy. W ich przebiegu zachodzą intensywne procesy rozgałęziania dróg oddechowych, różnicowania nabłonka, rozwoju chrząstki i mięśni gładkich, dojrzewania naczyń krwionośnych oraz powstawania powierzchni oddechowej niezbędnej do wymiany gazowej po urodzeniu.

Autorzy badania wykorzystali płuca owiec, aby prześledzić zmiany zachodzące między 80. dniem ciąży, 120. dniem ciąży i terminem porodu przypadającym około 147. dnia. Zakres ten odpowiada późnym etapom rozwoju płuca, od późnej fazy rzekomogruczołowej do prenatalnej fazy pęcherzykowej.

Autorzy i ośrodki badawcze

Pracę przygotował zespół kierowany przez badaczy z Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University w Cleveland oraz Utah State University w Logan. Pierwszymi autorami, którzy wnieśli równorzędny wkład w badanie, byli Svyatoslav Tkachenko i Shih-Hsing Leir.

W zespole znaleźli się również Arnaud J. Van Wettere, Iuri Viotti Perisse, Yasmin Mustafa, Cheyenne M. Marriott, Tayler Patrick, Ying Liu, Kenneth L. White, Irina A. Polejaeva i Ann Harris. Koncepcję badania opracowały Ann Harris oraz Irina A. Polejaeva. Analizę bioinformatyczną danych scRNA-seq przeprowadził Svyatoslav Tkachenko, natomiast Ann Harris odpowiadała za interpretację danych i przygotowanie manuskryptu.

Publikacja ukazała się online 31 lipca 2026 roku w czasopiśmie Functional & Integrative Genomics.

Jak przeprowadzono analizę pojedynczych komórek

Materiał pochodził od owiec rasy American Romney. Analizowano zwierzęta typu dzikiego oraz owce z obustronną utratą funkcji genu CFTR. Ciąże prowadzące do uzyskania zwierząt CFTR−/− uzyskiwano między innymi za pomocą transferu jądra komórki somatycznej, a w części przypadków poprzez naturalne rozmnażanie.

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone i były nadzorowane przez Institutional Animal Care and Use Committee przy Utah State University, zgodnie z protokołem IACUC nr 10089. U wszystkich płodów i jagniąt wykonano badanie sekcyjne, dokumentowano zmiany makroskopowe, a próbki płuca utrwalano również do analizy histopatologicznej.

Do analizy scRNA-seq pobierano oddzielnie materiał z części proksymalnej i dystalnej prawego płuca. Określenia te odnosiły się do lokalizacji anatomicznej, a nie bezpośrednio do średnicy dróg oddechowych. Obszar proksymalny znajdował się u podstawy środkowego płata prawego płuca, w pobliżu oskrzela głównego, natomiast obszar dystalny pobierano z najbardziej doogonowej części prawego płata.

Do przygotowania pojedynczej biblioteki wykorzystywano około 3000–5000 komórek. Biblioteki tworzono za pomocą systemu 10x Genomics Chromium Single Cell 3′ Reagent Kit w wersji 3 lub 3.1, a następnie sekwencjonowano na platformie NovaSeq 6000.

Odczyty dopasowywano do genomu referencyjnego owcy Oar_v4.0/oviAri4 przy użyciu Cell Ranger 3.1.0. Komórki poddawano kontroli jakości z uwzględnieniem liczby odczytów, liczby wykrytych genów oraz udziału odczytów mitochondrialnych. Przed utworzeniem obiektów analitycznych usuwano także geny kodujące białka rybosomalne.

Normalizację, korekcję efektu serii, klasteryzację oraz redukcję wymiarów UMAP przeprowadzono w pakiecie Seurat 5.1.0. Markery poszczególnych klastrów identyfikowano na podstawie różnicowej ekspresji genów z wykorzystaniem analizy ROC. Uwzględniano geny obecne w co najmniej 5% komórek jednej z porównywanych populacji i wykazujące różnicę ekspresji wynoszącą co najmniej 0,25 w skali logarytmicznej.

Różnice udziału komórek poszczególnych typów między punktami czasowymi oceniano za pomocą testów permutacyjnych dostępnych w pakiecie scProportionTest. Dla każdego porównania wykonywano 1000 permutacji. Oddzielne analizy przeprowadzono dla proksymalnej i dystalnej części płuca oraz dla zwierząt WT i CFTR−/−.

Jak zmienia się skład komórkowy zdrowego płuca

Proksymalna część płuca między 80. a 120. dniem ciąży

W porównaniu materiału z 80. i 120. dnia ciąży badacze zidentyfikowali 20 klastrów komórkowych. Analiza obejmowała po czterech dawców w każdym punkcie czasowym. W 80. dniu część niedojrzałych komórek mezenchymalnych była trudna do jednoznacznego przypisania, ponieważ wykazywała mieszane profile markerów.

W 80. dniu stosunkowo liczniejsze były komórki intensywnie proliferujące, komórki o cechach szybko dzielących się fibroblastów pęcherzykowych AF1, dojrzałe fibroblasty AF1 oraz populacja komórek odpornościowych odpowiadająca prawdopodobnie głównie limfocytom T.

W 120. dniu obserwowano natomiast większy udział kilku bardziej zróżnicowanych populacji. Dotyczyło to komórek podstawnych, komórek rzęskowych, komórek wydzielniczych, chondrocytów, płucnych komórek neuroendokrynnych oraz różnych populacji komórek śródbłonka, w tym komórek śródbłonka naczyń i komórek wykazujących cechy śródbłonka tętniczego lub systemowego żylnego.

Zmniejszenie udziału słabo zróżnicowanych, szybko dzielących się komórek przy jednoczesnym zwiększeniu reprezentacji dojrzałych komórek nabłonkowych i śródbłonkowych odpowiada intensywnemu dojrzewaniu dróg oddechowych i naczyń.

Proksymalna część płuca między 120. dniem a terminem porodu

W kolejnym porównaniu, obejmującym cztery zwierzęta w 120. dniu oraz pięć zwierząt w terminie porodu, zidentyfikowano 22 klastry. W 120. dniu bardziej liczne były przede wszystkim komórki szybko proliferujące, fibroblasty AF1 oraz niedojrzałe komórki nabłonka pęcherzykowego AT1/AT0.

Pod koniec ciąży zwiększał się natomiast udział komórek wydzielniczych i podstawnych. Liczniejsze były również makrofagi, limfocyty T i komórki tuczne, a także kilka typów komórek śródbłonkowych. Wyniki wskazują, że w końcowym okresie rozwoju płuca obok dalszego różnicowania nabłonka dochodzi do dojrzewania przedziału naczyniowego i wyraźnej reorganizacji układu odpornościowego.

Dystalna część płuca między 80. a 120. dniem ciąży

W dystalnej części płuca badacze zidentyfikowali 16 klastrów komórkowych. Podobnie jak w części proksymalnej, w 80. dniu liczniejsze były populacje szybko dzielących się, niedojrzałych komórek oraz fibroblastów.

W 120. dniu zwiększała się reprezentacja niedojrzałych komórek rzęskowych, komórek nabłonka pęcherzykowego AT1, AT2 i AT0, niedojrzałych komórek wydzielniczych, chondrocytów oraz komórek śródbłonka naczyń. Nieznacznie zwiększał się także udział makrofagów pęcherzykowych.

Obraz ten odpowiada przechodzeniu od fazy intensywnej proliferacji do coraz bardziej wyspecjalizowanej organizacji struktur odpowiedzialnych za przewodzenie powietrza, unaczynienie i przyszłą wymianę gazową.

Dystalna część płuca między 120. dniem a terminem porodu

Porównanie obejmujące cztery zwierzęta w 120. dniu oraz sześć zwierząt w terminie porodu ujawniło 22 klastry. W 120. dniu większy był udział komórek proliferujących, fibroblastów AF1, niedojrzałych komórek AT2/AT0 oraz chondrocytów.

W terminie porodu liczniejsze były perycyty, makrofagi pęcherzykowe, limfocyty T, limfocyty T γδ, komórki śródbłonka naczyń oraz komórki mięśni gładkich naczyń i dróg oddechowych. W przeciwieństwie do części proksymalnej, w dystalnym płucu nie stwierdzono w tym okresie wyraźnej nadreprezentacji określonych typów komórek nabłonkowych.

Różnica ta odzwierciedla odmienne funkcje anatomiczne obu regionów. W proksymalnej części płuca pod koniec ciąży intensywnie dojrzewa nabłonek dróg oddechowych, natomiast w części dystalnej szczególnie widoczne są zmiany w obrębie mikrokrążenia, mięśni gładkich i układu odpornościowego.

Różnice między płucami zdrowymi i płucami z utratą funkcji CFTR

Kolejnym etapem badania było porównanie przebiegu zmian rozwojowych u owiec WT i zwierząt CFTR−/−. Autorzy chcieli ustalić, czy brak funkcjonalnego CFTR wpływa na skład komórkowy płuca jeszcze przed porodem. U człowieka wyraźny obraz choroby płuc związanej z mukowiscydozą rzadko stwierdza się bezpośrednio po urodzeniu, jednak nie wyklucza to występowania wcześniejszych zmian na poziomie komórkowym lub molekularnym.

Zmiany między 80. a 120. dniem ciąży

W proksymalnym płucu owiec CFTR−/− w 80. dniu liczniejsze były populacje szybko proliferujące, wtórne miofibroblasty grzebieniowe, fibroblasty AF1 oraz komórki wydzielnicze. W 120. dniu zwiększał się udział limfocytów T i B, komórek śródbłonkowych oraz kilku typów komórek nabłonkowych, w tym komórek podstawnych wykazujących ekspresję TP63 i komórek pęcherzykowych.

Ogólny kierunek dojrzewania płuc WT i CFTR−/− był na tym etapie podobny. Pojawiły się jednak różnice mogące wskazywać na początek zaburzeń komórkowych. Limfocyty T i niedojrzałe limfocyty B były nadmiernie reprezentowane w 120. dniu wyłącznie u owiec CFTR−/−. Jednocześnie w płucach tych zwierząt nie obserwowano charakterystycznego dla WT wzrostu udziału komórek wydzielniczych, chondrocytów i płucnych komórek neuroendokrynnych.

Podobny sygnał pojawił się w dystalnej części płuca. W 120. dniu u zwierząt CFTR−/− liczniejsze były limfocyty T i B oraz makrofagi pęcherzykowe. Niedojrzałe limfocyty B i limfocyty T były nadreprezentowane tylko w płucu z utratą funkcji CFTR, podczas gdy niedojrzałe komórki rzęskowe, komórki wydzielnicze i chondrocyty były bardziej reprezentowane u zwierząt WT.

Wyraźniejsze różnice pod koniec ciąży

Największe rozbieżności między płucami WT i CFTR−/− pojawiły się między 120. dniem a terminem porodu. W proksymalnym płucu zdrowych owiec pod koniec ciąży zwiększał się udział komórek podstawnych, wydzielniczych, limfocytów T, fibroblastów AF2 i komórek śródbłonka limfatycznego.

Takiego obrazu nie stwierdzono u zwierząt CFTR−/−. W ich płucach w terminie porodu nadmiernie reprezentowane były przede wszystkim komórki rzęskowe, makrofagi pęcherzykowe oraz komórki śródbłonka naczyń i śródbłonka systemowych naczyń żylnych.

Nadmiar komórek rzęskowych był szczególnie istotnym sygnałem, ponieważ potwierdzał wcześniejsze obserwacje tego zespołu badawczego. Jednocześnie w płucach CFTR−/− brakowało spodziewanego, obserwowanego u zwierząt WT zwiększenia udziału innych dojrzałych populacji nabłonkowych, zwłaszcza komórek podstawnych i wydzielniczych.

Różnice stwierdzono również w dystalnej części płuca. W terminie porodu u owiec CFTR−/− liczniejsze były komórki rzęskowe, makrofagi, perycyty oraz komórki śródbłonka naczyń i naczyń limfatycznych. U zwierząt WT bardziej reprezentowane były natomiast komórki mięśni gładkich dróg oddechowych i naczyń oraz limfocyty T, w tym limfocyty T γδ.

Znaczenie wyników dla badań nad mukowiscydozą

Badanie dostarcza dowodów na to, że zmiany związane z brakiem funkcjonalnego CFTR mogą być wykrywalne w płucu jeszcze przed urodzeniem. Nie są to jednak zmiany odpowiadające w pełni rozwiniętej chorobie oskrzelowo-płucnej obserwowanej u starszych pacjentów z mukowiscydozą. Autorzy opisali raczej subtelne, ale powtarzalne zaburzenia proporcji komórek i przebiegu ich dojrzewania.

W części proksymalnej szczególnie istotna była przewaga komórek rzęskowych i brak spodziewanego wzrostu liczby komórek podstawnych oraz wydzielniczych. Komórki podstawne są ważnym przedziałem progenitorowym nabłonka dróg oddechowych, natomiast komórki wydzielnicze uczestniczą między innymi w tworzeniu i regulacji warstwy śluzowej oraz w lokalnej obronie wrodzonej.

Zmiana proporcji tych populacji może potencjalnie wpływać na sposób organizacji nabłonka już przed pierwszym kontaktem płuca z powietrzem i drobnoustrojami. Badanie nie pozwala jednak stwierdzić, czy obserwowane różnice bezpośrednio prowadzą do późniejszego upośledzenia oczyszczania śluzowo-rzęskowego lub zwiększonej podatności na zakażenia.

Równie ważne są zmiany dotyczące komórek odpornościowych. Nadreprezentacja limfocytów T i niedojrzałych limfocytów B w 120. dniu ciąży może wskazywać, że utrata funkcji CFTR wpływa na kształtowanie lokalnego środowiska immunologicznego. Potrzebne są jednak dalsze badania umożliwiające rozróżnienie między fizjologicznym dojrzewaniem układu odpornościowego a procesem chorobowym.

Autorzy udostępnili dane sekwencyjne w bazie Gene Expression Omnibus pod numerem GSE281174. Umożliwia to innym zespołom ponowną analizę danych, porównywanie ich z atlasami ludzkiego płuca oraz poszukiwanie szlaków molekularnych mogących uczestniczyć w rozwoju wczesnego fenotypu mukowiscydozy.

Ograniczenia modelu i najważniejsze wnioski

Najważniejszym ograniczeniem jest wykorzystanie modelu zwierzęcego. Mimo licznych podobieństw między rozwojem płuca owcy i człowieka nie można zakładać, że czas pojawiania się, nasilenie i znaczenie wszystkich zmian komórkowych są identyczne.

Owce CFTR−/− wykazują ciężki fenotyp jelitowy i obecnie nie przeżywają okresu okołoporodowego. Uniemożliwia to prowadzenie długoterminowych badań czynności płuc, oczyszczania śluzowo-rzęskowego, odpowiedzi na zakażenia i rozwoju przewlekłego zapalenia. Autorzy zaznaczyli, że przezwyciężenie problemu jelitowego poprzez korekcję genetyczną lub farmakologiczną pozwoliłoby w przyszłości ocenić funkcjonalne następstwa prenatalnych zmian w płucu.

Analiza proporcji komórek zależy również od skuteczności izolacji poszczególnych populacji. Autorzy zwrócili uwagę między innymi na zmienny udział komórek erytroidalnych, który prawdopodobnie odzwierciedlał skuteczność ich usuwania podczas przygotowywania zawiesiny pojedynczych komórek, a nie rzeczywistą cechę biologiczną badanego płuca.

Trudności dotyczyły także klasyfikacji części niedojrzałych komórek mezenchymalnych i nabłonkowych. We wczesnych punktach czasowych komórki mogą jednocześnie wykazywać markery kilku linii rozwojowych, co utrudnia ich jednoznaczne przypisanie do dojrzałego typu komórkowego.

Źródło: Functional & Integrative Genomics, „Developmental dynamics of ovine lung in health and cystic fibrosis at single-cell resolution”.
DOI: https://doi.org/10.1007/s10142-026-01981-2