Pseudomonas aeruginosa nie działa w izolacji. Model dróg oddechowych ujawnia rolę innych bakterii

Skutki obecności Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych mogą zależeć nie tylko od samego patogenu, ale również od innych bakterii tworzących lokalną społeczność mikrobiologiczną. Naukowcy z Dalhousie University opracowali laboratoryjny model ludzkiej bariery dróg oddechowych, który pozwala przez 24 godziny obserwować jednocześnie nabłonek i przestrzennie ograniczone społeczności bakteryjne. W badaniu Rothia mucilaginosa i Lacticaseibacillus casei osłabiały część efektów uszkadzających związanych z Pseudomonas aeruginosa, natomiast współobecność Streptococcus pneumoniae zwiększała przepuszczalność bariery. Wyniki opublikowano jako zaakceptowany manuskrypt w czasopiśmie Biomedical Materials. Badanie ma charakter przedkliniczny i nie stanowi podstawy do stosowania którejkolwiek z badanych bakterii jako terapii u pacjentów.

Drogi oddechowe jako środowisko wielogatunkowe

Klasyczne laboratoryjne modele zakażeń układu oddechowego często koncentrują się na oddziaływaniu jednego patogenu na komórki gospodarza. Tymczasem w rzeczywistych drogach oddechowych mikroorganizmy funkcjonują w znacznie bardziej złożonych społecznościach. Mogą ze sobą konkurować, współpracować, zmieniać ekspresję czynników wirulencji oraz pośrednio modyfikować odpowiedź komórek gospodarza.

Problem jest szczególnie istotny w przewlekłych chorobach płuc. Autorzy pracy zwracają uwagę między innymi na mukowiscydozę, w której zaburzony klirens śluzowo-rzęskowy i zagęszczony śluz tworzą nisze sprzyjające powstawaniu społeczności wielogatunkowych. Wśród bakterii obecnych w takim środowisku wymieniane są między innymi Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i przedstawiciele rodzaju Burkholderia.

Podobne zależności wielogatunkowe obserwuje się również w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc i rozstrzeniach oskrzeli, gdzie zmiany składu mikrobiomu wiążą się z ryzykiem zaostrzeń i pogorszeniem czynności płuc.

Jednym z podstawowych problemów eksperymentalnych pozostaje jednak odtworzenie takich interakcji w laboratorium. Pseudomonas aeruginosa rośnie bardzo szybko, dlatego w tradycyjnej płynnej współhodowli może w krótkim czasie zdominować środowisko, wyczerpać składniki odżywcze i doprowadzić do rozległego uszkodzenia nabłonka. Autorzy wskazują, że klasyczne układy bez ograniczenia wzrostu bakterii często pozwalają na wiarygodną obserwację jedynie przez około 4-8 godzin.

Dwuwarstwowy model ludzkiej bariery dróg oddechowych

Zespół Sarah M. Spencer, Karli N. Valenzueli-Valderas, Zhenyu Chenga oraz Brendana M. Leunga z Dalhousie University w Halifax w Kanadzie opracował system umożliwiający wydłużenie jednoczesnej hodowli bakterii i komórek gospodarza przy zachowaniu możliwości ilościowej oceny funkcji bariery.

W badaniu wykorzystano ludzkie komórki nabłonka oskrzelowego 16HBE14o- oraz ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej HUVEC. Komórki umieszczano po przeciwnych stronach błony wkładu typu Transwell, tworząc model nabłonkowo-śródbłonkowy.

W badania zaangażowane były trzy jednostki Dalhousie University: School of Biomedical Engineering, Faculties of Medicine and Engineering; Department of Biomaterials & Applied Oral Science, Faculty of Dentistry oraz Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine.

Nie jest to pełny model fizjologicznego ludzkiego oskrzela. Wykorzystano unieśmiertelnione linie komórkowe, a HUVEC nie są komórkami śródbłonka mikrokrążenia płucnego. Autorzy świadomie przyjęli taki układ jako kompromis pomiędzy złożonością biologiczną a dostępnością i powtarzalnością platformy.

PEG i dekstran ograniczyły ekspansję bakterii

Kluczowym elementem eksperymentu był wodny układ dwufazowy ATPS, złożony z glikolu polietylenowego i dekstranu. W badaniu zastosowano 5% PEG o masie 35 kDa i 5% dekstran o masie 500 kDa.

Bakterie umieszczano w niewielkiej kropli fazy bogatej w dekstran znajdującej się w otoczeniu fazy bogatej w PEG. Napięcie międzyfazowe ograniczało przemieszczanie całych komórek bakteryjnych poza kroplę, jednocześnie umożliwiając dyfuzję rozpuszczalnych czynników pomiędzy bakteriami a komórkami gospodarza.

Autorzy wykazali, że sama 24-godzinna ekspozycja na fazę PEG nie powodowała istotnego pogorszenia integralności bariery. Przepuszczalność dla 40-kDa FITC-dekstranu pozostawała bardzo mała: średnio 0,41 ± 0,16% po ekspozycji na PEG oraz 0,89 ± 0,89% w kontroli bez PEG.

W dodatkowych obserwacjach bez komórek ssaczych granica pomiędzy fazami PEG i DEX pozostawała zachowana przez co najmniej wymagane 24 godziny, a poszczególne warunki obserwowano do 45 godzin.

Jakie bakterie badano?

Do walidacji platformy wybrano cztery gatunki:

• Pseudomonas aeruginosa PAO1,
• Streptococcus pneumoniae D39,
• Rothia mucilaginosa 5762/67,
• Lacticaseibacillus casei 03.

Pseudomonas aeruginosa badano zarówno w monokulturze, jak i w połączeniu z każdym z pozostałych gatunków. Celem nie było odtworzenie kompletnego mikrobiomu dróg oddechowych konkretnego pacjenta, ale sprawdzenie, czy platforma potrafi odtworzyć kierunek znanych interakcji patogen-komensal i patogen-patogen.

Oceniano przepuszczalność bariery przy użyciu 40-kDa FITC-dekstranu, wydzielanie IL-6 i IL-8, żywotność komórek, architekturę połączeń zawierających E-kadherynę i ZO-1 oraz liczebność bakterii.

Pseudomonas aeruginosa silnie zwiększała przepuszczalność bariery

Pierwszym etapem było porównanie nieograniczonego wzrostu P. aeruginosa z warunkami, w których bakterie pozostawały ograniczone przez ATPS.

Przy nieograniczonym wzroście P. aeruginosa przepuszczalność bariery gwałtownie rosła. Po 6 godzinach pomiaru wynosiła średnio około 81,8%, a po 24 godzinach około 98,3%, co odpowiadało niemal całkowitemu zniszczeniu funkcjonalnej szczelności modelu.

W modelu z przestrzennie ograniczoną P. aeruginosa uszkodzenie było znacznie wolniejsze. Po 6 godzinach przepuszczalność wynosiła około 12,3%, a po 24 godzinach około 50,3%.

Obserwacje immunofluorescencyjne były zgodne z wynikami funkcjonalnymi. Przy nieograniczonym wzroście P. aeruginosa po 24 godzinach obserwowano niemal całkowitą utratę warstwy komórkowej oraz sygnału E-kadheryny i ZO-1. W warunkach ATPS zachowywano ciągłą warstwę komórek i lepiej widoczną architekturę połączeń.

Inne bakterie zmieniały wpływ P. aeruginosa na barierę

Najważniejsza część doświadczenia dotyczyła porównania samej P. aeruginosa oraz współhodowli z pozostałymi gatunkami.

Współhodowla z L. casei oraz R. mucilaginosa zmniejszała zaburzenie przepuszczalności obserwowane przy samej P. aeruginosa. Odmienny kierunek obserwowano dla S. pneumoniae: połączenie obu patogenów dawało najwyższe wartości przepuszczalności spośród analizowanych warunków.

Bakterie stosowane samodzielnie nie wywoływały w tym modelu porównywalnego zaburzenia bariery. Przepuszczalność wynosiła około 0,48 ± 0,30% dla L. casei, 0,91 ± 0,67% dla R. mucilaginosa oraz 2,21 ± 3,76% dla S. pneumoniae.

Różnic nie tłumaczyła większa śmierć komórek

Autorzy sprawdzili, czy różnice przepuszczalności mogły wynikać po prostu z różnic w cytotoksyczności. Odsetek martwych komórek pozostawał niski i nie różnił się istotnie statystycznie pomiędzy analizowanymi warunkami zakażenia. W analizie ANOVA uzyskano p = 0,89.

Oznacza to, że obserwowane różnice funkcji bariery nie były łatwo wyjaśnialne samą utratą żywotności komórek nabłonka.

Zmieniała się architektura połączeń międzykomórkowych

W obecności samej P. aeruginosa lokalizacja E-kadheryny i ZO-1 stawała się bardziej nieciągła i punktowa. Ilościowa analiza sieci E-kadheryny wykazała zwiększoną fragmentację połączeń w porównaniu z niezakażoną kontrolą.

W warunkach wielogatunkowych część architektury połączeń pozostawała zachowana. Szczególnie widoczny był kierunek poprawy przy współhodowli P. aeruginosa z L. casei. Co interesujące, przy jednoczesnej obecności P. aeruginosa i S. pneumoniae struktura części połączeń wyglądała na względnie zachowaną mimo dużej przepuszczalności funkcjonalnej.

Efekt osłabienia uszkodzenia nie wynikał z zahamowania wzrostu P. aeruginosa

Badacze analizowali również liczebność bakterii po 24 godzinach. Pseudomonas aeruginosa osiągała ponad 10⁸ CFU/ml zarówno w monokulturze, jak i w warunkach wielogatunkowych.

Oznacza to, że mniejsze uszkodzenie bariery obserwowane przy współhodowli z L. casei nie może być prosto tłumaczone brakiem wzrostu P. aeruginosa. Wynik sugeruje raczej możliwość zmiany interakcji patogenu z gospodarzem lub jego fenotypu w obecności innych mikroorganizmów.

Skład społeczności bakteryjnej zmieniał odpowiedź zapalną

Autorzy analizowali również stężenia IL-6 i IL-8 w płynie pobranym ze szczytowej części modelu po 24 godzinach.

Odpowiedź cytokinowa nie była prostym odzwierciedleniem stopnia uszkodzenia bariery. Warunki wielogatunkowe obejmujące L. casei lub S. pneumoniae wraz z P. aeruginosa zwiększały uwalnianie IL-8. Sama S. pneumoniae również wiązała się ze zwiększeniem sygnału zapalnego.

Autorzy podkreślają, że odpowiedź IL-8 jest dynamiczna. Pomiar wykonany po 24 godzinach przedstawia jedynie jeden punkt czasowy, a poziom cytokiny może być wynikiem równowagi pomiędzy produkcją przez gospodarza a bakteryjnym hamowaniem lub degradacją.

Co może odpowiadać za obserwowane różnice?

Badanie nie identyfikowało bezpośrednio pojedynczego bakteryjnego czynnika odpowiedzialnego za zmiany przepuszczalności bariery.

Autorzy omawiają możliwość udziału czynników wirulencji P. aeruginosa, w tym proteaz i innych wydzielanych produktów wpływających na połączenia międzykomórkowe. W przypadku S. pneumoniae rozważane są również mechanizmy związane z bakteryjnymi czynnikami uszkadzającymi nabłonek.

Nie były to jednak eksperymenty z mutantami pozbawionymi konkretnych toksyn, dlatego nie można przypisać obserwowanych efektów do pojedynczego mechanizmu.

Wyniki dotyczące L. casei i R. mucilaginosa sugerują z kolei, że obecność innych bakterii może modyfikować reakcję bariery na P. aeruginosa bez konieczności eliminowania samego patogenu.

Znaczenie badania dla mukowiscydozy i innych przewlekłych chorób dróg oddechowych

W przewlekłych zakażeniach i kolonizacji dróg oddechowych u osób z mukowiscydozą nie występuje wyłącznie jeden gatunek bakterii. Środowisko dróg oddechowych ma charakter wielogatunkowy, a jego skład może zmieniać zachowanie poszczególnych drobnoustrojów i odpowiedź gospodarza.

Badanie Spencer i współpracowników dostarcza przede wszystkim narzędzia umożliwiającego bardziej kontrolowane badanie takich zależności. Autorzy wskazują, że platforma może być w przyszłości rozszerzana o pierwotne komórki człowieka, komórki układu odpornościowego oraz społeczności drobnoustrojów pochodzące od pacjentów.

Ograniczenia badania

Autorzy wskazują, że kolejne badania powinny wykorzystywać między innymi pierwotne komórki dróg oddechowych, komórki układu odpornościowego, szczepy bakteryjne pozbawione wybranych czynników wirulencji, częstsze pobieranie próbek oraz podejścia wieloomiczne.

W praktyce klinicznej

Badanie nie zmienia obecnie zasad diagnostyki ani leczenia zakażeń Pseudomonas aeruginosa. Jego znaczenie polega przede wszystkim na pokazaniu, że efekt biologiczny patogenu może zależeć od innych drobnoustrojów znajdujących się w tym samym środowisku.

Dwa środowiska zawierające podobną liczebność P. aeruginosa mogą potencjalnie różnić się wpływem na nabłonek, jeżeli różni je skład pozostałej społeczności mikrobiologicznej. W przedstawionym modelu szczególnie dobrze ilustrowały to współhodowle z L. casei, R. mucilaginosa oraz S. pneumoniae.

Wyniki wzmacniają argument za dalszym badaniem mikrobiomu i interakcji wielogatunkowych w mukowiscydozie, rozstrzeniach oskrzeli oraz innych przewlekłych chorobach dróg oddechowych, ale nie pozwalają jeszcze przenosić obserwowanych efektów bezpośrednio na decyzje terapeutyczne.

Autorzy i ośrodki badawcze

Autorami pracy są Sarah M. Spencer, Karla N. Valenzuela-Valderas, Zhenyu Cheng oraz Brendan M. Leung. Autorem korespondencyjnym jest Brendan M. Leung.

Badania prowadzono w Dalhousie University w Halifax, Nova Scotia, Kanada, z udziałem School of Biomedical Engineering, Faculties of Medicine and Engineering; Department of Biomaterials & Applied Oral Science, Faculty of Dentistry oraz Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine.

Praca została przyjęta do publikacji w czasopiśmie Biomedical Materials i jest dostępna jako Accepted Manuscript.