Geny hns sterują przejściem Burkholderia cenocepacia do biofilmu. Nowe dane ważne dla mukowiscydozy

Przejście bakterii z ruchliwej, planktonicznej formy życia do biofilmu jest jednym z procesów sprzyjających ich długotrwałemu utrzymywaniu się w środowisku gospodarza. Naukowcy opisali złożoną sieć regulacyjną genów hns u Burkholderia cenocepacia H111 – bakterii należącej do kompleksu Burkholderia cepacia, którego przedstawiciele mogą przewlekle kolonizować drogi oddechowe osób z mukowiscydozą. Wyniki wskazują, że poszczególne białka H-NS nie działają jednakowo: H-NS_1.1 i H-NS_1.2 sprzyjają utrzymaniu bakterii w stanie ruchliwym, podczas gdy H-NS_3.1 wspiera przejście w kierunku fenotypu związanego z biofilmem.

Dlaczego przejście do biofilmu jest ważne w zakażeniach Burkholderia?

Bakterie należące do kompleksu Burkholderia cepacia (Bcc) mogą funkcjonować zarówno jako ruchliwe komórki żyjące w środowisku, jak i w postaci biofilmu. Ta zdolność zmiany trybu życia ma szczególne znaczenie w kontekście przewlekłych zakażeń, ponieważ fenotyp biofilmowy sprzyja utrzymywaniu się populacji bakteryjnej i jej adaptacji do długotrwałego zasiedlania gospodarza.

Burkholderia cenocepacia jest jednym z gatunków Bcc mogących kolonizować drogi oddechowe osób z mukowiscydozą. Dlatego poznanie mechanizmów regulujących przejście od ruchliwych bakterii do biofilmu może pomóc lepiej zrozumieć biologiczne podstawy przewlekłości takich zakażeń.

W badaniu opublikowanym w czasopiśmie Microbiology Spectrum zespół naukowców przeanalizował wszystkie pięć genów hns występujących u szczepu B. cenocepacia H111. Geny te kodują białka należące do rodziny H-NS, czyli białek związanych z bakteryjnym nukleoidem i uczestniczących w regulacji ekspresji wielu genów.

Autorzy i ośrodki prowadzące badanie

Autorami pracy są Ana Júlia Virgílio Tonhetta, Ludie Andrea Chunga Mozombite, Nathalia dos Santos Oliveira, Isabella Carolina Rodrigues dos Santos Goes, Pedro Hadime Hori, Leo Kei Iwai, João Vitor de Lima Galhardo, Tie Koide, Marcelo Brocchi, Cristina Elisa Alvarez-Martinez oraz Rogerio Ferreira Lourenço. Ana Júlia Virgílio Tonhetta i Ludie Andrea Chunga Mozombite wniosły równorzędny wkład w publikację.

Znaczna część zespołu była związana z Departamento de Genética, Evolução, Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas. W badaniu uczestniczyli również naukowcy z Departamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Laboratório de Toxinologia Aplicada, Centro de Toxinas, Resposta-Imune e Sinalização Celular (LETA/CeTICS), Instituto Butantan oraz Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo.

Rogerio Ferreira Lourenço, jeden z głównych autorów pracy, był afiliowany zarówno przy Universidade Estadual de Campinas, jak i Universidade Federal de São Paulo.

Jak zbadano pięć genów hns?

Badacze systematycznie ocenili znaczenie wszystkich pięciu genów hns dla fizjologii i patogenności szczepu B. cenocepacia H111. W tym celu konstruowano mutanty z delecją poszczególnych genów, wykorzystując rekombinację homologiczną, a następnie porównywano ich właściwości z komórkami szczepu rodzicielskiego.

Analizowano między innymi tempo wzrostu bakterii, tworzenie biofilmu na powierzchniach abiotycznych oraz ruchliwość typu swarming na podłożach półstałych. Biofilm ilościowo oceniano po barwieniu fioletem krystalicznym. Badania prowadzono zarówno w bogatym podłożu LLB, jak i w podłożu minimalnym M9 oraz w różnych temperaturach.

Dla genu hns_1.2, którego delecja wywoływała szczególnie wyraźny fenotyp, wykonano ponadto analizę porównawczą transkryptomu metodą RNA-seq. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie NextSeq 2000 z odczytami paired-end 2 × 100 bp. Wyniki różnicowej ekspresji genów zweryfikowano następnie dla wybranych genów metodą RT-qPCR.

Patogenność mutantów oceniono natomiast z użyciem larw Galleria mellonella, stanowiących model zakażenia stosowany w badaniach nad Bcc.

Przeciwstawne role H-NS_1.2 i H-NS_3.1

Usunięcie hns_1.1 lub hns_1.2 zaburzało wzrost bakterii. W przypadku mutanta pozbawionego hns_1.2 efekt był szczególnie wyraźny – kolonie mutantów pojawiały się później niż kolonie szczepu rodzicielskiego, a opóźnienie wzrostu potwierdzono również w hodowlach płynnych.

Najbardziej charakterystyczne różnice dotyczyły jednak równowagi między ruchliwością a biofilmem. W bogatym podłożu mutant Δhns_1.2 wykazywał zwiększoną adhezję przy granicy faz powietrze–ciecz. Efekt był jeszcze bardziej nasilony po dodaniu glukozy. W hodowlach bez glukozy obserwowano również agregaty komórek na dnie studzienek.

W podłożu minimalnym delecja hns_1.2 nie zmieniała istotnie ilości biofilmu. W tych warunkach zwiększenie biofilmu obserwowano natomiast po usunięciu hns_1.1, a jego zmniejszenie – po delecji hns_3.1. Wyniki wskazują więc, że względny udział poszczególnych białek H-NS zależy również od środowiska wzrostu bakterii.

Równie wyraźne były zmiany ruchliwości. Przy 37°C mutant Δhns_3.1 wykazywał większą ruchliwość typu swarming niż szczep rodzicielski. W temperaturze 22–25°C usunięcie hns_1.1 lub hns_1.2 prowadziło natomiast do wyraźnego ograniczenia rozprzestrzeniania bakterii po półstałym podłożu.

Co ujawniła analiza transkryptomu?

Jednym z najważniejszych elementów pracy była analiza zmian ekspresji genów po delecji hns_1.2. RNA-seq wykazał, że w mutancie Δhns_1.2 51 genów miało obniżoną, a 299 genów podwyższoną ekspresję. Łącznie odpowiadało to około 5,1% wszystkich przewidywanych genów szczepu H111, co wskazuje na szeroki zakres regulacji zależnej od H-NS_1.2.

Wśród genów o zmniejszonej ekspresji znalazły się liczne geny związane z ruchem zależnym od wici i chemotaksją. Dotyczyło to genów uczestniczących w budowie wici, generowaniu momentu obrotowego i kontroli jej ruchu w odpowiedzi na bodźce chemiczne.

Odwrotny obraz obserwowano dla wielu genów związanych z adhezją i tworzeniem biofilmu. W komórkach pozbawionych hns_1.2 zwiększała się ekspresja między innymi genów bcl kodujących lektyny, jednostki transkrypcyjnej obejmującej gen adhezyny bapA, a także genów odpowiedzialnych za biosyntezę cepacianu – jednego z głównych egzopolisacharydów Bcc.

Podwyższona była również ekspresja genów kodujących elementy kilku układów fimbrialnych i pilusa typu Flp. Autorzy zwracają uwagę, że nie wszystkie przewidywane układy adhezji i syntezy polisacharydów reagowały w ten sam sposób, co sugeruje względnie selektywną kontrolę określonych zestawów genów przez H-NS_1.2.

Zmiany obejmowały również geny związane z wirulencją

Do genów regulowanych przez H-NS_1.2 zaliczono również zmpA i zmpB, kodujące wydzielane proteazy. W mutancie Δhns_1.2 zwiększona była ponadto ekspresja części klastra systemu sekrecji typu VI (T6SS), w tym genów związanych z elementami kurczliwej osłonki, rurką Hcp i białkiem VgrG.

Autorzy zidentyfikowali także zmiany dotyczące potencjalnych genów efektorowych i odpornościowych powiązanych z vgrG. Wyniki sugerują więc, że funkcja H-NS_1.2 wykracza poza samą regulację biofilmu i może obejmować rozległą sieć genów związanych z oddziaływaniem bakterii z otoczeniem.

Powiązanie z quorum sensing

Znaczna część genów kontrolowanych przez system quorum sensing CepIR znajdowała się również wśród genów zależnych od H-NS_1.2. Autorzy rozważają więc model, w którym CepR może pełnić funkcję czynnika przeciwdziałającego wyciszaniu transkrypcji przez H-NS_1.2.

Według tej hipotezy CepR, wiążąc się z określonymi miejscami DNA, mógłby wypierać H-NS_1.2 i umożliwiać ekspresję genów. Dane sugerują również potencjalny udział drugiego układu quorum sensing zależnego od BDSF i białka RpfR.

Wpływ genów hns na wirulencję w modelu Galleria mellonella

Badacze sprawdzili także, czy zmiany w genach hns wpływają na zdolność bakterii do zabijania larw Galleria mellonella. Mutant pozbawiony hns_1.1 wykazywał osłabioną wirulencję względem szczepu rodzicielskiego. W przypadku mutanta Δhns_3.1 obserwowano natomiast opóźnienie kinetyki zabijania larw.

Nie stwierdzono analogicznej istotnej zmiany wirulencji po delecji hns_1.2 w tym modelu ostrego zakażenia. Autorzy podkreślają, że może to wynikać z różnic między mechanizmami istotnymi dla ostrego zakażenia a właściwościami sprzyjającymi przewlekłemu zasiedlaniu tkanek i tworzeniu biofilmu.

Znaczenie wyników dla badań nad zakażeniami w mukowiscydozie

Praca rozszerza wiedzę o mechanizmach molekularnych regulujących przejście B. cenocepacia z ruchliwego trybu życia do biofilmu. Jest to szczególnie interesujące w kontekście mukowiscydozy, ponieważ biofilm jest jednym z elementów umożliwiających bakteriom długotrwałe utrzymywanie się w drogach oddechowych.

Najważniejszy biologicznie wniosek dotyczy tego, że rodzina H-NS u B. cenocepacia nie stanowi jednego, funkcjonalnie jednorodnego systemu. Poszczególne białka mogą wykazywać częściowo przeciwstawne działanie. H-NS_1.2 silnie ogranicza ekspresję licznych genów związanych z adhezją, egzopolisacharydami i innymi elementami fenotypu biofilmowego, podczas gdy H-NS_3.1 może pośrednio sprzyjać uwalnianiu części tych genów spod represji.

Interesujące jest również powiązanie tej regulacji z quorum sensing. Jeżeli kolejne badania potwierdzą zaproponowany mechanizm w warunkach bardziej zbliżonych do dróg oddechowych osób z mukowiscydozą, sieć H-NS–CepIR–RpfR może stać się ważnym obszarem dalszych badań nad adaptacją B. cenocepacia podczas przewlekłego zakażenia.

Co jeszcze pozostaje do wyjaśnienia?

Autorzy zwracają uwagę, że mechanizm nie jest kompletny. Aktywacja quorum sensing może tłumaczyć zmiany ekspresji części genów zależnych od H-NS_1.2, ale nie wyjaśnia wszystkich obserwowanych efektów. Dotyczy to między innymi części genów związanych z systemem T6SS.

Nie wszystkie białka H-NS miały również widoczny wpływ na biofilm i ruchliwość w zastosowanych warunkach. Delecja hns₂ nie zmieniała tych fenotypów, podobnie jak delecja hns_3.2. Autorzy nie wykluczają jednak, że geny te mogą mieć większe znaczenie w innych warunkach środowiskowych. Wcześniejsze dane ekspresyjne sugerują bowiem, że poziomy poszczególnych białek H-NS mogą zmieniać się np. podczas stresu oksydacyjnego, fazy stacjonarnej lub ograniczenia dostępności azotu.

Wnioski

Badanie pokazuje, że przejście B. cenocepacia H111 pomiędzy ruchliwym fenotypem a biofilmem jest regulowane przez funkcjonalnie zróżnicowaną sieć białek H-NS. Szczególnie istotne wydają się H-NS_1.2 i H-NS_3.1, które wywierają przeciwstawny wpływ na ekspresję genów związanych z ruchliwością i tworzeniem biofilmu.

Delecja hns_1.2 prowadziła do szerokiego przeprogramowania transkryptomu, obejmującego setki genów, ze zmniejszeniem ekspresji genów związanych z wiciami i chemotaksją oraz zwiększeniem ekspresji szeregu genów adhezji, egzopolisacharydów i innych czynników potencjalnie związanych z wirulencją. Z kolei brak hns_3.1 powodował przesunięcie fenotypu w przeciwnym kierunku.

W praktyce klinicznej wyniki te nie zmieniają obecnie postępowania z zakażeniami Bcc u osób z mukowiscydozą. Dostarczają jednak istotnych danych mechanistycznych pomagających zrozumieć, w jaki sposób B. cenocepacia może regulować przejście w kierunku stylu życia sprzyjającego przewlekłej kolonizacji.