Utrata genu galU ogranicza biofilm i zjadliwość Pseudomonas aeruginosa

Usunięcie większości genu galU z genomu laboratoryjnego szczepu Pseudomonas aeruginosa PAO1 doprowadziło do utraty O-antygenu lipopolisacharydu, spowolnienia wzrostu bakterii, ograniczenia tworzenia biofilmu i osłabienia wielu czynników wirulencji. Jednocześnie zmiana zwiększyła podatność bakterii na kolistynę, polimyksynę B i fluorochinolony, ale zmniejszyła podatność na ceftazydym, meropenem i gentamycynę. Wyniki wskazują, że GalU może być interesującym celem terapii przeciwwirulencyjnej, jednak ingerencja w ten szlak może wywoływać złożone i częściowo przeciwstawne następstwa dla skuteczności antybiotyków.

Znaczenie genu galU i O-antygenu

Pseudomonas aeruginosa jest oportunistyczną bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za zakażenia występujące przede wszystkim u pacjentów z zaburzeniami odporności, uszkodzeniem barier nabłonkowych, przewlekłymi chorobami układu oddechowego lub wymagających wentylacji mechanicznej. Patogen ma szczególne znaczenie w mukowiscydozie, rozstrzeniach oskrzeli, przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc oraz zapaleniu płuc związanym z wentylacją mechaniczną.

Trudności terapeutyczne wynikają nie tylko z naturalnej i nabytej oporności P. aeruginosa na antybiotyki. Bakteria wytwarza również biofilm, liczne toksyny, proteazy, siderofory i polisacharydy zewnątrzkomórkowe. Może ponadto modyfikować strukturę swojej błony zewnętrznej, ograniczać penetrację leków i przystosowywać metabolizm do warunków panujących w drogach oddechowych.

Jednym z istotnych elementów błony zewnętrznej jest lipopolisacharyd, zbudowany z lipidu A, oligosacharydu rdzeniowego i O-antygenu. O-antygen jest najbardziej zewnętrzną i zróżnicowaną częścią LPS. Wpływa między innymi na interakcje bakterii z układem odpornościowym, rozpoznawanie przez bakteriofagi oraz odporność na niektóre czynniki środowiskowe i przeciwdrobnoustrojowe.

Gen galU koduje UDP-glucose pyrophosphorylase. U wielu bakterii zaburzenie jego funkcji prowadzi do powstania tak zwanego szorstkiego LPS, pozbawionego prawidłowego O-antygenu lub zawierającego skrócone struktury cukrowe. W izolatach P. aeruginosa pochodzących z płuc pacjentów z zaawansowaną mukowiscydozą również obserwowano fenotyp szorstkiego LPS, co wskazuje, że modyfikacje tej struktury mogą być jednym z elementów długotrwałej adaptacji patogenu do środowiska dróg oddechowych.

Zespół kierowany przez Congrana Li i Xuefu You postanowił systematycznie ocenić, jak usunięcie galU wpływa na fenotyp, zjadliwość, metabolizm i podatność na antybiotyki P. aeruginosa. Wśród autorów pracy znaleźli się również Jie Yu, Jinying Wang, Yan Yang, Lang Sun, Xinxin Hu, Tongying Nie, Xinyi Yang i Xiukun Wang.

Badania przeprowadzono między innymi w Beijing Key Laboratory of Technology and Application for Anti-infective New Drugs Research and Developments/Department of Pharmacology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Medical Research Center, the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University, the Third People’s Hospital of Chengdu, Hebei Key Laboratory of Pathogenic Mechanisms and Diagnosis & Treatment Technologies for Lung Microbiome oraz State Key Laboratory of Respiratory Health and Multimorbidity.

Projekt badania i zastosowane modele

Badacze wykorzystali referencyjny szczep P. aeruginosa PAO1. Za pomocą systemu CRISPR/Cas9 usunęli fragment obejmujący 826 par zasad, od pozycji −1 do 825 genu galU. W genomie mutanta pozostał jedynie krótki, 15-nukleotydowy fragment genu. Powstały szczep oznaczono jako PAO1ΔgalU.

Aby sprawdzić, czy obserwowane następstwa rzeczywiście wynikają z utraty funkcji galU, skonstruowano także szczep komplementowany. Do bakterii PAO1ΔgalU wprowadzono plazmid pUCP18-galU zawierający prawidłową wersję genu. Przywracanie fenotypu po komplementacji stanowiło ważny element potwierdzający związek między delecją genu a obserwowanymi zmianami.

Skuteczność modyfikacji potwierdzono za pomocą PCR, sekwencjonowania metodą Sangera oraz oznaczania ekspresji genu. Analiza LPS metodą elektroforezy i barwienia srebrem wykazała zmniejszenie masy cząsteczkowej oraz skrócenie struktur LPS po delecji galU, zgodne z utratą prawidłowego O-antygenu.

Następnie oceniano tempo wzrostu bakterii, tworzenie biofilmu, ruchliwość, produkcję piocyjaniny, piowerdyny i zewnątrzkomórkowych polisacharydów, aktywność proteolityczną, zdolność adhezji do komórek nabłonkowych oraz podatność na fagocytozę. Zbadano także minimalne stężenia hamujące dziewięciu antybiotyków.

Do doświadczeń komórkowych wykorzystano linię A549, wywodzącą się z ludzkiego gruczolakoraka płuca, oraz mysie makrofagi RAW264.7. Zjadliwość in vivo oceniano w modelu dootrzewnowego zakażenia myszy ICR. Zwierzętom podawano około 1 × 10⁸ jednostek tworzących kolonie bakterii, a przeżycie obserwowano przez pięć dni.

Delecja galU spowolniła wzrost i ograniczyła tworzenie biofilmu

Usunięcie galU wiązało się z wyraźnym kosztem biologicznym. Względna szybkość wzrostu mutanta wynosiła 0,65 w porównaniu ze szczepem dzikim, dla którego przyjęto wartość 1. Czas podwojenia populacji wydłużył się z 25,4 minuty w PAO1 do 39,4 minuty w PAO1ΔgalU. Po przywróceniu genu czas podwojenia wynosił 24,6 minuty, a względna szybkość wzrostu powróciła do 1,03.

Jeszcze silniejszy efekt obserwowano w badaniu biofilmu. Absorbancja po barwieniu safraniną wynosiła 2,27 dla szczepu dzikiego i jedynie 0,62 dla mutanta. Po komplementacji galU wartość wzrosła do 2,12. Oznacza to, że utrata funkcji genu doprowadziła do znacznego ograniczenia ilości biomasy biofilmu, a przywrócenie genu niemal całkowicie odwróciło ten efekt.

Ograniczenie ruchliwości bakterii

Mutant wykazywał słabszą zdolność pływania i przemieszczania się po powierzchni podłoża. Najbardziej wyraźne ograniczenie dotyczyło ruchliwości typu swarming, która wiąże się z koordynowanym przemieszczaniem populacji bakterii. Po ponownym wprowadzeniu prawidłowego galU ruchliwość wracała do poziomu zbliżonego do szczepu dzikiego.

Zmniejszenie ruchliwości może utrudniać rozprzestrzenianie się bakterii, kolonizację nowych powierzchni oraz organizowanie przestrzennej struktury biofilmu. Analiza ekspresji genów wykazała między innymi obniżenie ekspresji flp i kilku genów związanych z pilusami oraz systemami adhezji.

Mniejsza produkcja czynników wirulencji

Po delecji galU zmniejszyła się produkcja kilku istotnych czynników zjadliwości. Stężenie piocyjaniny obniżyło się z 1,34 do 1,13 µg/ml. Piocyjanina jest barwnikiem i toksycznym metabolitem zdolnym między innymi do zaburzania funkcji nabłonka oddechowego, generowania stresu oksydacyjnego oraz modulowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

Jeszcze większą różnicę stwierdzono w przypadku piowerdyny. Intensywność fluorescencji spadła z 62 304 dla PAO1 do 36 726 dla PAO1ΔgalU. Piowerdyna jest sideroforem wychwytującym żelazo ze środowiska. Niedobór tego związku może ograniczać zdolność bakterii do pozyskiwania żelaza i zmniejszać jej przystosowanie do warunków panujących w organizmie gospodarza.

Delecja zmniejszała również całkowitą aktywność proteolityczną oraz aktywność stafylolityczną związaną z metaloproteazą LasA. Zaobserwowano ponadto mniejszą produkcję EPS, czyli zewnątrzkomórkowych składników macierzy biofilmu.

Obrazowanie w skaningowym mikroskopie elektronowym wykazało, że między komórkami szczepu dzikiego znajdowały się liczne struktury włókniste, prawdopodobnie odpowiadające składnikom zewnątrzkomórkowej macierzy. U mutanta struktury te były znacznie mniej liczne. Same komórki zachowywały ciągłość, ale częściej miały krótszy i grubszy kształt.

Słabsza adhezja i większa podatność na fagocytozę

Zdolność PAO1ΔgalU do przylegania do komórek A549 była istotnie mniejsza niż w przypadku szczepu dzikiego. Ponowne wprowadzenie galU przywracało adhezję do wartości zbliżonych do PAO1.

Jednocześnie mutant był łatwiej pochłaniany przez makrofagi RAW264.7. Liczba bakterii wykrywanych wewnątrz makrofagów wynosiła około 1067 CFU/ml dla PAO1ΔgalU i 333 CFU/ml dla PAO1. Wynik wskazuje na osłabienie zdolności bakterii do unikania fagocytozy.

Różnice potwierdził model zwierzęcy. Po pięciu dniach przeżyło jedynie 10% myszy zakażonych szczepem dzikim, natomiast w grupie zakażonej PAO1ΔgalU przeżycie wyniosło 80%. Wprowadzenie prawidłowej kopii genu ponownie zwiększyło zjadliwość: przeżyło 20% zwierząt zakażonych szczepem komplementowanym.

Wyniki te łącznie wskazują, że GalU uczestniczy w wielu procesach ważnych dla patogenności P. aeruginosa. Nie chodzi wyłącznie o budowę LPS. Zaburzenie funkcji tego enzymu wpływało równocześnie na wzrost, biofilm, ruchliwość, produkcję sideroforu i toksycznych metabolitów, adhezję oraz unikanie odpowiedzi fagocytarnej.

Podatność na antybiotyki zmieniła się w dwóch przeciwnych kierunkach

Jednym z najważniejszych wyników badania było wykazanie, że delecja galU nie zwiększała podatności bakterii na wszystkie antybiotyki. Efekt zależał od klasy leku.

MIC polimyksyny B i kolistyny zmniejszyły się czterokrotnie, z 1 do 0,25 µg/ml. Dwukrotnie zmniejszyły się również wartości MIC lewofloksacyny i cyprofloksacyny. Jednocześnie MIC ceftazydymu wzrosło czterokrotnie, natomiast MIC meropenemu i gentamycyny wzrosły dwukrotnie.

Dlaczego mutant był bardziej podatny na kolistynę?

Polimyksyny oddziałują z ujemnie naładowanymi składnikami LPS, przede wszystkim w obrębie lipidu A i rdzenia lipopolisacharydu. Autorzy założyli, że usunięcie O-antygenu może ograniczyć przeszkodę przestrzenną i ułatwić cząsteczkom kolistyny dostęp do miejsca wiązania.

Hipotezę sprawdzono metodą izotermicznego miareczkowania kalorymetrycznego. Stała dysocjacji dla wiązania kolistyny z LPS szczepu dzikiego wynosiła 0,228 mM, natomiast dla LPS mutanta 0,0171 mM. Mniejsza wartość stałej dysocjacji oznacza większe powinowactwo. LPS pozbawiony prawidłowego O-antygenu wykazywał zatem około 13-krotnie większe powinowactwo do kolistyny.

Jednoczesny wzrost MIC leków beta-laktamowych

Wzrost MIC ceftazydymu i meropenemu pokazuje jednak, że zahamowanie GalU nie może być automatycznie traktowane jako uniwersalny sposób uwrażliwiania bakterii na leczenie. Zmiany w LPS, błonie zewnętrznej, metabolizmie, regulacji stresu i ekspresji transporterów mogą powodować odmienne następstwa dla różnych klas antybiotyków.

Autorzy analizowali między innymi ekspresję operonu PA1874–PA1877 i regulatora brlR, związanych z tolerancją biofilmu na niektóre antybiotyki. Ekspresja PA1874 i brlR była obniżona u mutanta, co mogło częściowo przyczyniać się do większej podatności na fluorochinolony. Mechanizm zwiększenia MIC ceftazydymu, meropenemu i gentamycyny nie został jednak jednoznacznie wyjaśniony.

Badacze podjęli również próbę farmakologicznego ograniczenia aktywności GalU za pomocą difosforanu urydyny, opisywanego wcześniej jako potencjalny inhibitor tego enzymu. Dodanie związku nie wywołało jednak wyraźnych zmian MIC ceftazydymu, meropenemu ani gentamycyny w ośmiu klinicznych izolatach P. aeruginosa.

Zmiany ekspresji genów, quorum sensing i metabolizmu

Analiza transkryptomiczna wykazała ekspresję 5666 genów wspólnych dla PAO1 i PAO1ΔgalU. Oprócz samego galU kryteria istotnej zmiany ekspresji spełniło 30 genów: 19 było aktywowanych, a 11 hamowanych.

Zmiany obejmowały geny związane z układami dwuskładnikowymi, transportem, metabolizmem aminokwasów, metabolizmem siarki, quorum sensing oraz tworzeniem struktur powierzchniowych. Obniżona była między innymi ekspresja genów tadZ, rcpA, flp, PA4648 i PA4649. Aktywowane były natomiast między innymi arnB, PA5169, PA0265, PA0266, PA0603 i PA0604.

Wiele genów operonów pvc, cup, flp i cupE wykazywało kierunkowo zmniejszoną ekspresję. Operony cup kodują składniki systemów chaperone/usher, uczestniczących w tworzeniu struktur adhezyjnych i organizacji biofilmu. Obniżenie ich aktywności jest zgodne ze słabszą adhezją, ograniczeniem biofilmu i mniejszą ruchliwością obserwowaną w eksperymentach fenotypowych.

Proponowany udział metabolizmu tyrozyny

Autorzy zwrócili uwagę na możliwy związek między utratą galU, szlakiem Entnera–Doudoroffa, przemianami GABA, cyklem kwasów trikarboksylowych i metabolizmem tyrozyny. U mutanta zwiększone były stężenia glukozo-6-fosforanu, pirogronianu i bursztynianu. Wartości te obniżały się po ponownym wprowadzeniu prawidłowego genu.

Dodanie do hodowli egzogennego GABA lub tyrozyny zwiększało tworzenie biofilmu przez PAO1ΔgalU około 1,33–1,64 raza w porównaniu z hodowlą bez suplementacji. Autorzy zaproponowali, że zmieniony przepływ metabolitów może ograniczać dostępność tyrozyny, osłabiać aktywność operonów pvc i cup, a w konsekwencji zmniejszać powstawanie struktur adhezyjnych oraz biofilmu.

Model ten należy jednak traktować jako hipotezę wymagającą dalszego potwierdzenia. W badaniu oznaczono bezpośrednio G6P, pirogronian i bursztynian, ale nie przedstawiono bezpośredniego pomiaru wewnątrzkomórkowego stężenia tyrozyny. Zależności między poszczególnymi metabolitami, ekspresją operonów i fenotypem biofilmu zostały częściowo wywnioskowane z danych transkryptomicznych, suplementacji GABA i tyrozyną oraz wcześniejszych publikacji.

Znaczenie dla zakażeń układu oddechowego i mukowiscydozy

Z klinicznego punktu widzenia badanie jest istotne, ponieważ P. aeruginosa jest jednym z najważniejszych patogenów przewlekle kolonizujących drogi oddechowe osób z mukowiscydozą. W czasie wieloletniej infekcji bakteria podlega silnej presji selekcyjnej związanej z odpornością gospodarza, niedotlenieniem, dostępnością składników odżywczych, biofilmem i wielokrotną antybiotykoterapią.

W takich warunkach mogą pojawiać się warianty o zmniejszonej ruchliwości, ograniczonej produkcji części ostrych czynników wirulencji i zmienionym LPS. Nie musi to jednak oznaczać, że stają się one klinicznie niegroźne. W przewlekłej infekcji mniejsza zjadliwość w modelu ostrego zakażenia może współistnieć z lepszym przystosowaniem do długotrwałego utrzymywania się w biofilmie i unikania eliminacji przez leczenie.

W prezentowanym badaniu delecja galU powodowała duży koszt wzrostowy i wyraźnie ograniczała biofilm, dlatego nie można bezpośrednio utożsamiać badanego mutanta z adaptacyjnymi wariantami izolowanymi z dróg oddechowych pacjentów. Szczepy kliniczne mają zwykle liczne, nakładające się mutacje, które mogą częściowo kompensować utratę określonych funkcji.

Sami autorzy zwracają uwagę, że silne upośledzenie wzrostu może zwiększać presję selekcyjną sprzyjającą powstawaniu mutacji kompensacyjnych. W organizmie takie zmiany mogłyby stopniowo przywracać sprawność biologiczną bakterii, jednocześnie modyfikując jej wrażliwość na leki i czynniki odpornościowe.

Wynik dotyczący kolistyny może być szczególnie interesujący w zakażeniach dróg oddechowych, ponieważ lek ten jest stosowany między innymi w terapii wziewnej przewlekłych zakażeń P. aeruginosa. Nie wiadomo jednak, czy zwiększone powinowactwo kolistyny do LPS mutanta przełożyłoby się na skuteczniejsze usuwanie bakterii w warunkach biofilmu, śluzu, nierównomiernej penetracji leku i obecności zróżnicowanych subpopulacji bakteryjnych.

GalU jako cel terapii przeciwwirulencyjnej

Koncepcja leczenia przeciwwirulencyjnego polega na ograniczaniu zdolności patogenu do uszkadzania gospodarza, kolonizacji tkanek lub unikania odpowiedzi odpornościowej, bez konieczności bezpośredniego zabijania bakterii. Teoretycznie może to zmniejszać presję selekcyjną prowadzącą do klasycznej oporności. W przypadku galU sytuacja okazuje się jednak bardziej złożona.

Utrata funkcji genu rzeczywiście osłabiała wiele cech związanych ze zjadliwością. Jednocześnie powodowała głęboką przebudowę metabolizmu, błony zewnętrznej i odpowiedzi na antybiotyki. Wzrost MIC ceftazydymu, meropenemu i gentamycyny wskazuje, że potencjalna terapia skierowana przeciwko GalU musiałaby zostać szczegółowo zbadana w skojarzeniu z lekami stosowanymi klinicznie.

Przed rozważeniem badań klinicznych konieczne byłyby doświadczenia na większej liczbie szczepów, w tym izolatach pochodzących od pacjentów z mukowiscydozą, rozstrzeniami oskrzeli i przewlekłą infekcją. Potrzebne są także modele nabłonka dróg oddechowych, organoidy, hodowle na granicy powietrze–płyn oraz zwierzęce modele zakażenia płucnego.

Istotne będzie również ustalenie, czy częściowe zahamowanie enzymu daje taki sam efekt jak prawie całkowita utrata genu. W praktyce lek rzadko blokuje cel molekularny w sposób absolutny i trwały. Nawet niewielka zachowana aktywność GalU może wystarczyć do utrzymania syntezy części struktur LPS albo prowadzić do innego profilu adaptacji niż obserwowany u mutanta genetycznego.

Źródło: Virulence, Multifaceted effects of galU deletion on phenotype and virulence of Pseudomonas aeruginosa in vitro and in vivo.
DOI: https://doi.org/10.1080/21505594.2026.2707803