Jak działa Alyftrek na F508del-CFTR? Nowe dane o wanzakaftorze i deutiwakaftorze

Nowe badanie mechanistyczne pokazuje, w jaki sposób składniki terapii Alyftrek – wanzakaftor, tezakaftor i deutiwakaftor – wpływają na nieprawidłowo sfałdowane białko F508del-CFTR. W doświadczeniach przeprowadzonych na pierwotnych komórkach nabłonka oskrzelowego pochodzących od osób z mukowiscydozą oraz w modelu komórkowym CFBE41o− S-enancjomer wanzakaftoru wykazywał bardzo wysoką aktywność korekcyjną, która dodatkowo zwiększała się w obecności tezakaftoru. Deutiwakaftor zapewniał natomiast odpowiedź funkcjonalną porównywalną z iwakaftorem w zastosowanych układach eksperymentalnych. Wyniki dostarczają również nowych informacji o stereoselektywności wanzakaftoru: R-enancjomer był znacznie słabszym korektorem F508del-CFTR i przy dużych stężeniach antagonizował działanie formy S.

W artykule:

• Dlaczego badano składniki terapii Alyftrek
• Autorzy, ośrodki badawcze i zastosowane metody
• S-wanzakaftor i przywracanie funkcji F508del-CFTR
• Deutiwakaftor w porównaniu z iwakaftorem
• Dlaczego enancjomery S i R wanzakaftoru działają inaczej
• Niższe stężenia modulatorów, znaczenie kliniczne i ograniczenia badania

Dlaczego badano składniki terapii Alyftrek

Mukowiscydoza jest chorobą autosomalną recesywną spowodowaną patogennymi wariantami genu CFTR. Kodowane przez ten gen białko CFTR pełni funkcję kanału anionowego w błonie komórek nabłonkowych. Zaburzenia jego syntezy, dojrzewania, transportu do błony lub funkcji prowadzą do nieprawidłowego transportu jonów i wody przez nabłonek, co leży u podstaw wielonarządowych objawów mukowiscydozy.

F508del jest najczęstszym wariantem CFTR związanym z mukowiscydozą. Powoduje przede wszystkim zaburzenie prawidłowego fałdowania białka. Znaczna część F508del-CFTR zostaje rozpoznana przez wewnątrzkomórkowe mechanizmy kontroli jakości i skierowana do degradacji, zanim osiągnie błonę komórkową. Ta część zmutowanego białka, która dociera do błony, wykazuje dodatkowo zaburzenia bramkowania oraz ograniczoną stabilność.

Modulatory CFTR oddziałują bezpośrednio na te zaburzenia molekularne. Korektory poprawiają fałdowanie, dojrzewanie i transport CFTR do błony komórkowej, natomiast potencjatory zwiększają aktywność kanału obecnego już w błonie.

Alyftrek jest terapią potrójną zawierającą dwa korektory – wanzakaftor i tezakaftor – oraz potencjator deutiwakaftor. W publikacji badacze stosują dla tej kombinacji skrót VTD, pochodzący od angielskich nazw vanzacaftor/tezacaftor/deutivacaftor. Deutiwakaftor jest deuterowanym analogiem iwakaftoru, charakteryzującym się zmienionymi właściwościami farmakokinetycznymi i wydłużonym okresem półtrwania.

Skuteczność kliniczna kombinacji wanzakaftor/tezakaftor/deutiwakaftor była już wcześniej oceniana w badaniach klinicznych. Autorzy omawianej pracy zwrócili jednak uwagę, że szczegółowa charakterystyka działania jej poszczególnych składników na poziomie komórkowym – zwłaszcza deutiwakaftoru oraz dwóch enancjomerów wanzakaftoru – pozostawała ograniczona.

Autorzy, ośrodki badawcze i zastosowane metody

Pierwszą autorką pracy jest Sandra Mirval, natomiast autorem korespondencyjnym i osobą odpowiedzialną za zaprojektowanie eksperymentów był prof. Frédéric Becq. Wśród współautorów znaleźli się również Louise Damy, Auguste Sauvage-de-Gérando, Christine Barrault, Isabelle Fixe, Edouard Sage, Christelle Coraux, Benjamin Simonneau, Bénédicte Duriez, Pascale Fanen, Anne Cantereau oraz Clarisse Vandebrouck.

Badanie było efektem współpracy kilku francuskich jednostek naukowych i klinicznych:

• Laboratoire de physiopathologie et régulation des transports ioniques, Pôle Biologie Santé, Université de Poitiers,
• INRAE UMR 0892, Université Versailles-Saint-Quentin-en-Yvelines,
• Service de Chirurgie Thoracique et Transplantation Pulmonaire, Hôpital Foch,
• Université de Reims-Champagne Ardenne, INSERM UMR-S 1250, P3Cell,
• Université Paris Est Créteil, INSERM, IMRB,
• UAR Bios, Plateforme IMAGE-UP, Université de Poitiers.

Jednym z istotnych elementów projektu było wykorzystanie pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzelowego HBE. Badacze analizowali komórki pochodzące od czterech dawców z genotypem F508del/F508del oraz od dwóch dawców z genotypami złożonymi F508del/R1162X i F508del/W1282X. Materiał uzyskano po transplantacji płuc w Hôpital Foch.

Równolegle wykorzystywano linię komórkową CFBE41o− z ekspresją F508del-CFTR. Jako jeden z układów kontrolnych zastosowano komórki CFBE41o− eksprymujące CFTR typu dzikiego.

Jak oceniano funkcję CFTR?

Komórki poddawano 24-godzinnej ekspozycji na poszczególne modulatory lub ich kombinacje. S-wanzakaftor badano w szerokim zakresie stężeń, a w oddzielnych eksperymentach analizowano także jego R-enancjomer. Aktywność deutiwakaftoru porównywano z aktywnością iwakaftoru.

Jedną z podstawowych metod były pomiary prądu zwarciowego w komorach Ussinga. Forskolina aktywowała szlak zależny od cAMP, zwiększając aktywność CFTR, natomiast CFTRinh-172 służył do swoistego zahamowania kanału. Pozwalało to ilościowo określić komponent transportu jonowego zależny od CFTR.

Autorzy zastosowali ponadto technikę whole-cell patch-clamp, umożliwiającą bezpośrednią ocenę prądów chlorkowych w komórkach.

Na poziomie biochemicznym wykorzystano Western blot. Analiza pozwalała rozróżnić niedojrzałą postać CFTR, odpowiadającą prążkowi B, od dojrzałej, kompleksowo glikozylowanej postaci określanej jako prążek C. Wzrost udziału prążka C wskazywał na poprawę dojrzewania F508del-CFTR.

Immunofluorescencja i mikroskopia konfokalna umożliwiały z kolei sprawdzenie, czy skorygowane białko dociera do błony apikalnej komórek.

S-wanzakaftor i przywracanie funkcji F508del-CFTR

Jednym z głównych celów badania było określenie zależności pomiędzy stężeniem S-wanzakaftoru a stopniem odzyskiwania funkcji F508del-CFTR.

W komórkach CFBE41o− eksprymujących F508del-CFTR, które przez 24 godziny poddawano jednocześnie działaniu 3 µM tezakaftoru i 1 µM iwakaftoru, zwiększanie stężenia S-wanzakaftoru od 0,1 nM do 300 nM powodowało stopniowy wzrost zależnego od CFTR prądu zwarciowego. Przy większych stężeniach odpowiedź osiągała plateau.

Wyliczone EC₅₀ dla odpowiedzi funkcjonalnej wynosiło 7,89 nM. EC₅₀ jest stężeniem substancji, przy którym uzyskuje się połowę maksymalnego efektu obserwowanego w danym układzie doświadczalnym.

Western blot wykazał równolegle zależne od stężenia zwiększanie ilości dojrzałej postaci F508del-CFTR. W tym doświadczeniu EC₅₀ dla dojrzewania białka wynosiło około 5,5 nM. Przy stężeniach S-wanzakaftoru od 100 do 3000 nM stopień dojrzewania F508del-CFTR osiągał wartości porównywalne z obserwowanymi w komórkach kontrolnych z CFTR typu dzikiego.

S-wanzakaftor działał także bez tezakaftoru

Aby określić własną aktywność korekcyjną S-wanzakaftoru, badacze przeprowadzili oddzielne doświadczenie, w którym komórki CFBE41o− z F508del-CFTR inkubowano przez 24 godziny z S-wanzakaftorem w stężeniach od 0,03 nM do 3 µM, bez drugiego korektora.

Także w tym układzie obserwowano zależny od stężenia wzrost funkcji F508del-CFTR. EC₅₀ dla odpowiedzi funkcjonalnej wynosiło około 130 nM.

Jednocześnie Western blot wykazywał zwiększanie ilości dojrzałej postaci białka, z EC₅₀ wynoszącym około 11 nM. Przy stężeniach S-wanzakaftoru 100–1000 nM wartości wskaźnika dojrzewania CFTR zbliżały się do obserwowanych w komórkach z CFTR typu dzikiego.

Porównanie około 130 nM podczas stosowania S-wanzakaftoru bez drugiego korektora z 7,89 nM w układzie zawierającym tezakaftor pokazuje, jak wyraźnie obecność drugiego korektora zwiększała skuteczność funkcjonalnej korekcji F508del-CFTR.

Skorygowane białko trafiało do błony apikalnej

Samo zwiększenie ilości dojrzałego CFTR nie oznacza jeszcze, że białko znalazło się we właściwym miejscu i jest funkcjonalne. Autorzy ocenili więc także lokalizację komórkową kanału.

Obrazowanie konfokalne wykazało zwiększenie ekspresji oraz przywrócenie apikalnej lokalizacji F508del-CFTR w komórkach leczonych ETI lub VTI. W komórkach kontrolnych eksponowanych na DMSO nie obserwowano analogicznego odtworzenia apikalnej lokalizacji białka.

Badania whole-cell patch-clamp potwierdziły, że w komórkach poddanych korekcji za pomocą S-wanzakaftoru i tezakaftoru powstawały wyraźne prądy chlorkowe zależne od CFTR. Aktywność kanału można było zwiększyć forskoliną i iwakaftorem, a następnie zahamować za pomocą CFTRinh-172.

Oznacza to, że korekcja nie ograniczała się do zwiększenia ilości białka. F508del-CFTR odzyskiwało prawidłową lokalizację w obrębie błony komórkowej i zdolność przewodzenia jonów chlorkowych.

Deutiwakaftor w porównaniu z iwakaftorem

Istotną częścią badania było porównanie aktywności dwóch potencjatorów CFTR: iwakaftoru i deutiwakaftoru.

Autorzy porównali dwie kombinacje, zachowując w publikacji skróty wynikające z angielskich nazw substancji:

• VTI – S-wanzakaftor + tezakaftor + iwakaftor,
• VTD – S-wanzakaftor + tezakaftor + deutiwakaftor, czyli kombinację odpowiadającą składnikom Alyftrek.

W pierwotnych komórkach HBE F508del/F508del oraz w komórkach CFBE41o− z F508del-CFTR obie kombinacje prowadziły do porównywalnego przywrócenia transportu chlorkowego zależnego od CFTR.

W HBE różnica pomiędzy VTI i VTD w zakresie prądu hamowanego przez CFTRinh-172 nie była istotna statystycznie – P=0,9803. Również w komórkach CFBE41o− nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy obiema kombinacjami – P=0,9934 dla odpowiedzi ocenianej po zahamowaniu CFTR.

Doświadczenia, w których stopniowo zwiększano stężenie iwakaftoru lub deutiwakaftoru po wcześniejszej korekcji za pomocą S-wanzakaftoru i tezakaftoru, także wykazały porównywalne odpowiedzi funkcjonalne.

Porównanie z ETI

Autorzy zestawiali odpowiedzi uzyskiwane po zastosowaniu kombinacji opartych na S-wanzakaftorze również ze schematem eleksakaftor/tezakaftor/iwakaftor (ETI).

W warunkach zastosowanych w tym badaniu odpowiedzi zależne od CFTR uzyskiwane po VTI lub VTD różniły się istotnie od odpowiedzi obserwowanych po ETI zarówno w pierwotnych komórkach HBE F508del/F508del, jak i w CFBE41o− z F508del-CFTR. Różnica była bardziej wyraźna w linii CFBE41o− niż w pierwotnych HBE.

W dodatkowej analizie biochemicznej pełne referencyjne stężenie VTI zastosowane w hodowli prowadziło do uzyskania większej ilości dojrzałej postaci F508del-CFTR niż pełne referencyjne stężenie ETI; różnica była istotna statystycznie – P=0,0136.

Nie można jednak na tej podstawie wnioskować o klinicznej przewadze jednej terapii nad drugą. Stężenia substancji stosowane w hodowli, czas ekspozycji i charakter modeli komórkowych nie odpowiadają bezpośrednio farmakokinetyce ani efektom klinicznym leczenia człowieka. Do klinicznego porównania terapii służą randomizowane badania przeprowadzone z udziałem pacjentów.

Komórki z genotypami F508del/R1162X i F508del/W1282X

Autorzy zbadali ponadto pierwotne komórki HBE pochodzące od dwóch dawców ze złożonymi genotypami F508del/R1162X oraz F508del/W1282X.

W omawianej publikacji R1162X i W1282X opisano jako warianty klasy I prowadzące do minimalnej ilości lub braku transkryptu CFTR. W zastosowanym modelu autorzy uznali więc, że obserwowane odzyskanie funkcji było związane z korekcją F508del-CFTR powstającego z drugiego allelu.

Porównano kombinację S-wanzakaftor + tezakaftor z eleksakaftor + tezakaftor. W obu genotypach leczenie prowadziło do istotnego zwiększenia odpowiedzi CFTR w stosunku do kontroli DMSO. Nie wykazano natomiast istotnych statystycznie różnic pomiędzy obiema kombinacjami korektorów: P=0,1784 dla F508del/R1162X oraz P=0,9487 dla F508del/W1282X.

Wyniki te należy interpretować ostrożnie, ponieważ każdy z dwóch genotypów reprezentowany był przez materiał pochodzący tylko od jednego dawcy biologicznego. W doświadczeniach wykonano powtórzenia techniczne, ale nie zwiększa to liczby niezależnych dawców.

Dlaczego enancjomery S i R wanzakaftoru działają inaczej

Jednym z najbardziej interesujących elementów pracy było bezpośrednie porównanie S- i R-enancjomeru wanzakaftoru.

Enancjomery mają taki sam wzór sumaryczny oraz układ wiązań, lecz różnią się konfiguracją przestrzenną. W farmakologii taka różnica może istotnie wpływać na sposób wiązania cząsteczki z białkiem docelowym i w konsekwencji na jej aktywność biologiczną.

Zarówno w pierwotnych HBE F508del/F508del, jak i w komórkach CFBE41o− z F508del-CFTR R-wanzakaftor wykazywał znacznie mniejszą aktywność korekcyjną niż S-wanzakaftor. Dotyczyło to zarówno stosowania bez tezakaftoru, jak i kombinacji z tym korektorem.

Jeszcze bardziej interesujący wynik uzyskano podczas jednoczesnego stosowania obu enancjomerów. Przy stałym stężeniu S-wanzakaftoru wynoszącym 300 nM stopniowe zwiększanie stężenia R-wanzakaftoru prowadziło do zmniejszenia odpowiedzi funkcjonalnej zależnej od F508del-CFTR. Najbardziej wyraźny i istotny statystycznie efekt obserwowano przy stężeniu R-wanzakaftoru wynoszącym 10 µM.

Western blot potwierdził równoległe zmniejszenie ilości dojrzałej postaci CFTR. Wyniki wskazują zatem na antagonizujące działanie R-enancjomeru wobec korekcji wywoływanej przez S-wanzakaftor.

Mechanizm antagonizmu pozostaje niewyjaśniony

Autorzy rozważają kilka możliwych mechanizmów obserwowanego antagonizmu. Jednym z nich mogłaby być konkurencja enancjomerów o częściowo nakładające się miejsca allosteryczne CFTR, w której słabiej działający R-wanzakaftor wypierałby bardziej aktywną formę S.

Alternatywnie R-wanzakaftor mógłby wiązać się z innym miejscem i stabilizować konformację CFTR mniej sprzyjającą prawidłowemu fałdowaniu i dojrzewaniu białka.

Autorzy przywołują w dyskusji wyniki badań strukturalnych dotyczących innych związków oddziałujących z CFTR. W omawianym doświadczeniu nie przeprowadzono jednak badań strukturalnych ani bezpośredniej analizy wiązania wanzakaftoru do CFTR.

Nie można więc obecnie uznać molekularnego mechanizmu antagonizmu pomiędzy R- i S-wanzakaftorem za wyjaśniony. Obserwacja wymaga dalszych badań strukturalnych i biofizycznych.

Niższe stężenia modulatorów, znaczenie kliniczne i ograniczenia badania

W końcowej części projektu autorzy sprawdzili, w jakim stopniu zmniejszenie stężeń modulatorów wpływa na odzyskanie funkcji i dojrzewania F508del-CFTR.

W szczegółowo opisanych doświadczeniach dotyczących redukcji stężeń wykorzystano VTI, czyli S-wanzakaftor, tezakaftor i iwakaftor. Jest to istotne rozróżnienie, ponieważ VTI nie jest składem produktu Alyftrek – w Alyftrek potencjatorem jest deutiwakaftor.

Za 100% referencyjnego stężenia VTI przyjęto w tych doświadczeniach:

• 300 nM S-wanzakaftoru,
• 3 µM tezakaftoru,
• 1 µM iwakaftoru.

Określenie „100%” dotyczy wyłącznie stężenia referencyjnego ustalonego w eksperymencie komórkowym. Nie oznacza 100% dawki klinicznej i nie może być przeliczane na liczbę tabletek ani dawkę przyjmowaną przez pacjenta.

Wyniki w pierwotnych komórkach HBE

W pierwotnych komórkach HBE F508del/F508del porównano referencyjne stężenie VTI z 50% i 10% tych wartości.

Pomiędzy warunkami 50% i 100% nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy w zależnym od CFTR prądzie – P=0,9983. Oznacza to, że w zastosowanym modelu dwukrotne zmniejszenie stężenia wszystkich trzech składników nie spowodowało mierzalnego pogorszenia odzyskanej funkcji CFTR.

Przy 10% referencyjnego stężenia VTI, odpowiadającego 30 nM S-wanzakaftoru, 300 nM tezakaftoru i 100 nM iwakaftoru, prąd zależny od CFTR był już istotnie mniejszy niż przy 100% stężenia – P=0,0428.

Wyniki w komórkach CFBE41o−

W komórkach CFBE41o− eksprymujących F508del-CFTR autorzy zastosowali szerszy zakres stężeń – 50%, 30%, 10%, 3% i 1% wartości referencyjnych VTI.

Zależna od F508del-CFTR sekrecja chlorków pozostawała wykrywalna nawet przy 3% referencyjnego stężenia VTI. Podobnie jak w pierwotnych HBE, pomiędzy warunkami 50% i 100% nie stwierdzono istotnej różnicy funkcjonalnej – P=0,8316.

Analiza Western blot wykazała ponadto zależny od stężenia wzrost ilości dojrzałej, kompleksowo glikozylowanej postaci CFTR. Przy 30% i 50% referencyjnego stężenia VTI poziom dojrzałego CFTR był porównywalny z obserwowanym przy 100% VTI.

W praktyce klinicznej

Autorzy zwracają uwagę, że wysoka aktywność S-wanzakaftoru i utrzymywanie się znacznej odpowiedzi CFTR przy mniejszych stężeniach modulatorów może stanowić przesłankę do dalszych badań nad optymalizacją ekspozycji na leczenie. W dyskusji odnoszą ten problem między innymi do potencjalnej poprawy tolerancji, przestrzegania zaleceń oraz dostępności terapii.

Jednocześnie podkreślają, że w przypadku wanzakaftoru nie przedstawiono modelowania farmakokinetycznego ani farmakodynamicznego pozwalającego na przełożenie stężeń stosowanych w hodowli na dawkowanie u człowieka.

Najważniejsze ograniczenia badania

Podstawowym ograniczeniem jest charakter in vitro pracy. Pierwotne komórki HBE są wartościowym i fizjologicznie istotnym modelem nabłonka dróg oddechowych, ale nie odwzorowują całej złożoności organizmu osoby z mukowiscydozą.

Model komórkowy nie pozwala w pełni odtworzyć między innymi odpowiedzi immunologicznej, właściwości śluzu, przewlekłego stanu zapalnego, interakcji z mikroorganizmami ani następstw długotrwałej ekspozycji całego organizmu na lek.

Drugim ograniczeniem jest brak badań strukturalnych i bezpośrednich badań wiązania, które pozwoliłyby określić molekularną przyczynę antagonizmu pomiędzy R- i S-wanzakaftorem.

Trzecim istotnym ograniczeniem pozostaje brak modelowania farmakokinetycznego i farmakodynamicznego, które pozwoliłoby przełożyć wyniki doświadczeń ze zmniejszonymi stężeniami na ekspozycję występującą podczas leczenia człowieka.

Ostrożności wymagają również wyniki dotyczące genotypów F508del/R1162X i F508del/W1282X, ponieważ każdy z nich był reprezentowany przez komórki pochodzące tylko od jednego dawcy biologicznego.

Co badanie wnosi do wiedzy o Alyftrek?

Praca Sandry Mirval i współautorów dostarcza przede wszystkim mechanistycznego wyjaśnienia wysokiej aktywności kombinacji opartych na S-wanzakaftorze.

Wyniki pokazują, że S-wanzakaftor:

• samodzielnie poprawia dojrzewanie i funkcję F508del-CFTR,
• wykazuje znacznie większą aktywność funkcjonalną w obecności tezakaftoru,
• zwiększa ilość dojrzałej postaci F508del-CFTR,
• sprzyja odzyskaniu apikalnej lokalizacji białka,
• umożliwia przywrócenie przewodnictwa chlorkowego zależnego od CFTR.

Badanie wskazuje również, że deutiwakaftor w zastosowanych modelach eksperymentalnych zachowuje aktywność potencjatora porównywalną z iwakaftorem, a działanie wanzakaftoru jest silnie zależne od konfiguracji przestrzennej cząsteczki.

R-wanzakaftor był znacznie słabszym korektorem F508del-CFTR, a przy dużych stężeniach ograniczał działanie S-wanzakaftoru. Jest to istotna obserwacja z punktu widzenia farmakologii molekularnej i dalszych badań nad sposobem wiązania korektorów do CFTR.

Autorzy wskazują, że kolejne badania powinny obejmować dodatkowe warianty CFTR, większą liczbę tkanek pochodzących od pacjentów, uzupełniające doświadczenia in vivo oraz modelowanie farmakokinetyczne pozwalające dokładniej określić zależność pomiędzy ekspozycją na modulatory a efektem biologicznym.

Finansowanie i konflikty interesów

Badanie było finansowane przez francuskie stowarzyszenie Vaincre la mucoviscidose w ramach grantów DiTCAP RF20221203263 oraz RF20250503706.

Autorzy zadeklarowali brak konfliktów interesów finansowych i innych.