BatR i SrkA sterują architekturą biofilmu Pseudomonas aeruginosa i jego odpowiedzią na antybiotyki

Naukowcy z brytyjskich ośrodków badawczych opisali wcześniej niescharakteryzowany układ regulacyjny, który wpływa na budowę biofilmu Pseudomonas aeruginosa, uwalnianie zewnątrzkomórkowego DNA, produkcję piocyjaniny oraz zdolność bakterii do przetrwania ekspozycji na subinhibicyjne stężenia antybiotyków. Kluczową rolę odgrywają niewielkie białko BatR i oddziałująca z nim kinaza SrkA. Wyniki uzyskane w modelach laboratoryjnych, syntetycznym modelu rany przewlekłej oraz modelu zakażenia oskrzelików świńskich ex vivo wskazują, że układ BatR/SrkA może pomagać Pseudomonas aeruginosa w organizowaniu struktury biofilmu i przystosowaniu do stresu antybiotykowego.

Dlaczego biofilm Pseudomonas aeruginosa utrudnia leczenie zakażeń

Pseudomonas aeruginosa jest oportunistycznym patogenem, który może wywoływać ostre i przewlekłe zakażenia dróg oddechowych, ran, oparzeń oraz tkanek otaczających cewniki i inne implanty medyczne. Szczególne znaczenie ma u osób z mukowiscydozą, u których przewlekłe zakażenie dolnych dróg oddechowych może prowadzić do postępującego uszkodzenia płuc, nawracających zaostrzeń i pogorszenia rokowania.

Jednym z najważniejszych mechanizmów utrzymywania się zakażenia jest zdolność bakterii do tworzenia biofilmu. Nie jest on jedynie przypadkowym skupiskiem komórek. To przestrzennie uporządkowana społeczność drobnoustrojów otoczonych macierzą zbudowaną m.in. z polisacharydów, białek i zewnątrzkomórkowego DNA. W obrębie biofilmu powstają gradienty tlenu, składników odżywczych i metabolitów, a poszczególne komórki mogą znacząco różnić się aktywnością metaboliczną.

Komórki położone w głębszych, słabiej natlenowanych częściach biofilmu mogą przechodzić w stan spowolnionego metabolizmu. Zmniejsza to skuteczność antybiotyków działających przede wszystkim na aktywnie dzielące się bakterie. Macierz biofilmu może ponadto ograniczać dyfuzję leków, a lokalne stężenie antybiotyku w zakażonej tkance bywa niższe niż stężenie konieczne do zahamowania wzrostu drobnoustroju.

Autorzy pracy zwracają uwagę, że subinhibicyjne stężenia leków nie są dla bakterii biologicznie obojętne. Mogą działać jak sygnał środowiskowy, uruchamiający odpowiedź stresową, zmiany w komunikacji międzykomórkowej, produkcji czynników wirulencji i strukturze biofilmu.

Autorzy i ośrodki uczestniczące w badaniu

Pracę opublikowano w czasopiśmie naukowym PLOS Pathogens pod tytułem „A novel stress response pathway mediates biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa”. Pierwszą autorką była Ainelen Piazza, a autorami korespondencyjnymi Ainelen Piazza i Jacob G. Malone.

W zespole znaleźli się również Catriona M. A. Thompson, Govind Chandra, Harshanie Dasanayaka, Gerhard Saalbach, Carlo Martins, Eleftheria Trampari, Mark A. Webber i Freya Harrison.

Badania prowadzono w kilku brytyjskich ośrodkach:

• Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Norwich Research Park,
• The Centre for Microbial Interactions, Norwich Research Park,
• John Innes Centre Proteomics Platform,
• Quadram Institute Bioscience, Norwich Research Park,
• School of Life Sciences, The University of Warwick,
• School of Biological Sciences, University of East Anglia.

Projekt łączył analizę bioinformatyczną, genetykę bakteryjną, proteomikę, mikroskopię poklatkową, badania oddziaływań białko–białko oraz dwa modele zakażeń o zwiększonej trafności biologicznej: syntetyczny model rany przewlekłej i model oskrzelików świńskich ex vivo odtwarzający wybrane cechy zakażenia płuc w mukowiscydozie.

BatR – małe białko o dużym znaczeniu dla biofilmu

Punktem wyjścia było słabo poznane białko kodowane przez gen PA3049. Wcześniej przypuszczano, że może ono odpowiadać białku RMF występującemu u Escherichia coli, które uczestniczy w przechodzeniu rybosomów w stan hibernacji podczas niedoboru składników odżywczych.

Analizy filogenetyczne i modelowanie strukturalne wykazały jednak, że białko PA3049 u Pseudomonas aeruginosa różni się od klasycznego RMF. Autorzy zidentyfikowali dodatkowe 15 aminokwasów na końcu C oraz przewidywaną dodatkową helisę alfa. Homologi tego białka występowały w obrębie γ-proteobakterii, ale warianty obecne u bakterii z rzędu Pseudomonadales tworzyły odrębną grupę ewolucyjną.

Ponieważ wyniki wskazywały na odmienną funkcję biologiczną, autorzy zmienili nazwę PA3049 na BatR – Biofilm architecture Regulator.

Delecja batR zwiększała wrażliwość biofilmu

Naukowcy przygotowali mutant Pseudomonas aeruginosa PAO1 pozbawiony genu batR. W hodowli płynnej minimalne stężenia hamujące piperacyliny i cyprofloksacyny nie różniły się między mutantem a szczepem dzikim. Oznacza to, że utrata BatR nie powodowała klasycznej zmiany MIC w warunkach planktonicznych.

Inaczej wyglądała sytuacja podczas wzrostu na powierzchni i w biofilmie. Mutant ΔbatR wykazywał o około 12–17 proc. większą wrażliwość na piperacylinę i cyprofloksacynę w teście dyfuzyjno-krążkowym. Zwiększona wrażliwość dotyczyła także tobramycyny.

W modelu biofilmu tworzonego na szklanych kulkach przeżywalność ustalonego biofilmu ΔbatR po ekspozycji na subinhibicyjne stężenie piperacyliny była wyraźnie niższa niż w przypadku szczepu dzikiego. Ponowne wprowadzenie genu batR przywracało fenotyp zbliżony do szczepu dzikiego.

Badanie z użyciem resazuryny nie wykazało natomiast istotnej zmiany przepuszczalności błony komórkowej. Zdaniem autorów oznacza to, że wpływ BatR na przeżywanie biofilmu nie wynika z prostego zwiększenia lub zmniejszenia dostępu antybiotyku do wnętrza komórki.

Zmiany w proteomie prowadziły do pyocyn

W analizie proteomicznej wykrywano średnio 4581 białek na próbkę, co odpowiadało około 80 proc. przewidywanego proteomu szczepu PAO1. Różnice między szczepem dzikim i mutantem ΔbatR były stosunkowo ograniczone, co sugerowało, że BatR nie wywołuje nieswoistej, globalnej reorganizacji metabolizmu.

Szczególnie istotne okazało się zmniejszenie ilości siedmiu białek należących do regionu genowego pyocyn R2/F2. Pyocyny są bakteriocynami przypominającymi struktury bakteriofagowe. Mogą uczestniczyć w konkurencji między bakteriami, ale związany z nimi aparat lityczny odpowiada również za gwałtowną lizę części komórek.

Taka „eksplozywna” liza prowadzi do uwalniania DNA genomowego do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. eDNA staje się następnie składnikiem macierzy, stabilizuje biofilm, wspiera adhezję i pomaga utrzymać przestrzenną strukturę społeczności bakteryjnej.

SrkA łączy regulację biofilmu z kontrolowaną śmiercią komórek

Aby ustalić, z jakimi białkami współpracuje BatR, badacze wykonali koimmunoprecypitację połączoną ze spektrometrią mas, a następnie zweryfikowali wybrane interakcje w bakteryjnym systemie dwuhybrydowym. Potwierdzono swoiste oddziaływanie BatR z białkiem PA0486, nazwanym SrkA – Stress response kinase A.

SrkA jest przewidywaną kinazą serynowo-treoninową typu eukariotycznego. Jej homolog u Escherichia coli był wcześniej wiązany z regulacją programowanej śmierci komórek w odpowiedzi na stres, natomiast funkcja SrkA u Pseudomonas aeruginosa pozostawała nieznana.

Modelowanie AlphaFold3 sugerowało, że BatR może oddziaływać w pobliżu centrum aktywnego SrkA. Pewność modelu interakcji była jednak niska, dlatego autorzy traktują ten element jako hipotezę strukturalną, a nie rozstrzygający dowód mechanizmu molekularnego.

Nadekspresja srkA nasilała tworzenie biofilmu

Nadekspresja srkA zwiększała ilość biofilmu mierzoną zarówno wiązaniem czerwieni Kongo na podłożu stałym, jak i barwieniem fioletem krystalicznym w hodowli statycznej. Wzrastała również produkcja piocyjaniny – niebieskozielonej fenazyny pełniącej funkcję czynnika wirulencji i aktywnego redoks metabolitu.

Co interesujące, wpływ SrkA na tworzenie biofilmu i śmierć komórek utrzymywał się także po wprowadzeniu mutacji unieczynniających przewidywane centrum katalityczne kinazy. Natomiast wpływ na produkcję piocyjaniny miał być zależny od aktywności enzymatycznej SrkA. Sugeruje to, że białko może uczestniczyć w co najmniej dwóch odmiennych mechanizmach regulacyjnych.

SrkA uruchamiała więcej niż jeden szlak lizy

Nawet niewielka indukcja nadekspresji srkA prowadziła w określonych warunkach do spadku żywotności bakterii o około trzy rzędy wielkości. W mikroskopii poklatkowej częstość komórek przechodzących w formę kulistą i ulegających gwałtownej lizie wzrosła z około 2–3 do 30–40 przypadków na 1000 komórek.

Usunięcie genu kodującego endolizynę Lys, należącą do kasety litycznej pyocyn R2/F2, osłabiało ten efekt, ale nie eliminowało go całkowicie. Nadal obserwowano około stukrotny spadek liczby żywych komórek. Wskazywało to na istnienie drugiego mechanizmu śmierci komórkowej.

Analiza mutantów, które przetrwały toksyczną nadekspresję nieaktywnego wariantu SrkA, skierowała uwagę na profaga Pf4. Badacze wykazali zwiększoną liczbę odczytów sekwencyjnych w regionie Pf4, a usunięcie integrazy tego profaga częściowo osłabiało działanie SrkA. Oznacza to, że SrkA może aktywować co najmniej dwa szlaki lizy:

• lizę zależną od endolizyny i klastra pyocyn R2/F2,
• mechanizm związany z aktywnością filamentowego bakteriofaga Pf4.

BatR wpływał na aktywność Pf4 i uwalnianie eDNA

Supernatanty ze szczepu dzikiego powodowały powstawanie stref lizy na murawie bakteryjnej, natomiast supernatanty mutanta ΔbatR nie wywoływały takiego efektu. Ponowne wprowadzenie batR przywracało aktywność lityczną.

W proteomice supernatantów w próbkach szczepu dzikiego wykryto zwiększoną ilość białka płaszczowego bakteriofaga Pf4. Jednocześnie stężenie zewnątrzkomórkowego DNA było istotnie wyższe w supernatantach szczepu dzikiego niż w materiale pochodzącym od mutanta ΔbatR.

Wyniki wskazują, że BatR nie tylko wpływa na ekspresję klastra pyocyn, ale także uczestniczy w aktywacji lub regulacji Pf4. Oba procesy mogą zwiększać uwalnianie eDNA i sprzyjać prawidłowej organizacji macierzy biofilmu.

Piocyjanina jako element odpowiedzi biofilmu

Piocyjanina jest fenazynowym pigmentem i czynnikiem wirulencji produkowanym przez większość szczepów Pseudomonas aeruginosa. Może uczestniczyć w reakcjach utleniania i redukcji, prowadzić do powstawania reaktywnych form tlenu, uszkadzać komórki gospodarza i wpływać na fizjologię biofilmu.

W środowisku ograniczonej dostępności tlenu piocyjanina może pełnić rolę przenośnika elektronów, wspierając ciągłość metaboliczną społeczności bakteryjnej. Może również wiązać się z eDNA i wpływać na agregację komórek. Z tego względu obserwowane powiązanie BatR i SrkA z produkcją piocyjaniny może mieć znaczenie zarówno dla struktury biofilmu, jak i jego tolerancji na stres.

Wyniki w modelach zakażenia płuc i ran przewlekłych

Autorzy nie ograniczyli się do prostych hodowli laboratoryjnych. Znaczenie BatR ocenili również w dwóch modelach odtwarzających wybrane cechy przewlekłych zakażeń: syntetycznym modelu rany oraz modelu oskrzelików świńskich ex vivo.

Syntetyczny model rany przewlekłej

Model syntetycznej rany zbudowano z macierzy kolagenowej i płynu imitującego środowisko zakażonej tkanki. Biofilmy rozwijano przez 24 godziny, a następnie poddawano działaniu cyprofloksacyny w stężeniach od 0 do 64 µg/ml.

Bez antybiotyku nie wykazano wyraźnej różnicy w liczbie bakterii między szczepem dzikim a mutantem ΔbatR. Po zastosowaniu cyprofloksacyny biofilm mutanta wykazywał jednak znacznie mniejszą przeżywalność. Przy wyższych stężeniach leku liczba odzyskiwanych komórek ΔbatR była prawie 40-krotnie niższa niż w przypadku szczepu dzikiego.

Model zakażenia oskrzelików w mukowiscydozie

Model EVPL wykorzystuje fragmenty świńskiego oskrzelika umieszczone w Synthetic Cystic Fibrosis Medium. Pozwala to odtworzyć część właściwości środowiska śluzu dróg oddechowych w mukowiscydozie oraz uzyskać biofilm o strukturze bardziej zbliżonej do obserwowanej w tkankach niż w klasycznej hodowli płynnej.

Doświadczenia prowadzono na fragmentach pochodzących z pięciu niezależnych płuc. Łącznie dla każdego szczepu analizowano 15 fragmentów oskrzelików. Biofilmy eksponowano na cyprofloksacynę w stężeniu 16 µg/ml, odpowiadającym jednej ósmej wartości MIC ustalonej w tym modelu.

Liczebność bakterii szczepu dzikiego nie zmniejszała się istotnie po zastosowaniu cyprofloksacyny. Mutant ΔbatR tworzył natomiast słabszy biofilm już bez leczenia, a po ekspozycji na antybiotyk jego obciążenie bakteryjne zmniejszało się dodatkowo. W warunkach stresu antybiotykowego liczba bakterii mutanta była około 2,5-krotnie niższa.

Zmiany architektury biofilmu w tkance

Fragmenty oskrzelików analizowano histologicznie po dwóch i siedmiu dniach zakażenia. W drugim dniu biofilmy szczepu dzikiego wykazywały większą intensywność barwienia, co wskazywało na większą masę i gęstość biofilmu.

Po siedmiu dniach biofilmy szczepu dzikiego przyjmowały charakterystyczną, gąbczastą strukturę z przestrzeniami rozdzielającymi fragmenty macierzy. Podobną morfologię opisywano wcześniej w materiale pochodzącym z dróg oddechowych osób z mukowiscydozą. Biofilm szczepu dzikiego miał grubszą warstwę macierzy oraz bardziej wyraźne cechy strukturalne niż biofilm mutanta ΔbatR.

Różnice utrzymywały się zarówno bez antybiotyku, jak i podczas ekspozycji na cyprofloksacynę. Zdaniem autorów deficyt eDNA i zmieniona aktywność układów litycznych mogą częściowo tłumaczyć mniejszą spójność architektoniczną biofilmu pozbawionego BatR.

Produkcja piocyjaniny w modelach zakażenia

W modelu płuca i modelu rany biofilmy szczepu dzikiego wykazywały silniejsze niebieskozielone zabarwienie niż biofilmy mutanta ΔbatR, szczególnie podczas ekspozycji na cyprofloksacynę. W modelu EVPL różnicę potwierdzono spektrofotometrycznym pomiarem piocyjaniny.

Wynik ten wzmacnia hipotezę, że BatR uczestniczy w skoordynowanej regulacji kilku właściwości społeczności bakteryjnej: budowy macierzy, metabolizmu redoks, odpowiedzi na stres i tolerancji na antybiotyki.

Znaczenie wyników i ograniczenia badania

Praca dostarcza nowego modelu regulacji biofilmu Pseudomonas aeruginosa. Według autorów SrkA bezpośrednio kontroluje część cech związanych z biofilmem, natomiast BatR działa jako partner modulujący aktywność SrkA w określonych warunkach środowiskowych.

Układ BatR/SrkA może synchronizować trzy grupy procesów:

• wytwarzanie składników umożliwiających przyłączanie komórek i formowanie macierzy,
• kontrolowaną lizę części populacji prowadzącą do uwalniania eDNA,
• produkcję piocyjaniny wspierającej metabolizm redoks i organizację biofilmu.

Najważniejszą wartością badania jest połączenie analiz molekularnych z modelami zakażeń. Efekt BatR był stosunkowo niewielki lub niewidoczny w klasycznej hodowli płynnej, ale stawał się wyraźny w biofilmach rozwijających się na powierzchniach, w macierzy kolagenowej i w tkance oskrzelikowej.

Pokazuje to, że mechanizmy ważne w przewlekłym zakażeniu mogą pozostawać niewidoczne w standardowych testach mikrobiologicznych. Brak zmiany MIC w hodowli planktonicznej nie oznaczał braku wpływu badanego białka na zdolność biofilmu do przetrwania ekspozycji na antybiotyk.

Najważniejsze ograniczenia

Badanie przeprowadzono przede wszystkim z wykorzystaniem laboratoryjnego szczepu PAO1. Szczepy kliniczne izolowane od osób z mukowiscydozą mogą wykazywać znaczne różnice genetyczne i fenotypowe, zwłaszcza po wielu latach adaptacji do środowiska dróg oddechowych.

Modele EVPL i syntetycznej rany są bardziej złożone niż klasyczna hodowla in vitro, lecz nadal nie odtwarzają pełnej odpowiedzi immunologicznej człowieka, farmakokinetyki leków, zmienności wydzieliny, współzakażeń ani wieloletniej ewolucji populacji bakteryjnej.

Część wniosków dotyczących interakcji strukturalnej BatR–SrkA oparto na modelowaniu AlphaFold3 o ograniczonej pewności. Wymaga to potwierdzenia metodami biologii strukturalnej i biochemii białek.

Nie jest również jasne, dlaczego silne fenotypy delecji srkA pojawiały się przede wszystkim w tle pozbawionym batR. Autorzy podejrzewają obecność dodatkowego, dotychczas niezidentyfikowanego regulatora, którego aktywność jest hamowana zarówno przez BatR, jak i SrkA.

Potencjalny kierunek dalszych badań

Autorzy wskazują, że mechanizmy regulujące podatność komórek biofilmu na lizę mogą w przyszłości stać się celami terapii osłabiających integralność biofilmu. Teoretycznie zaburzenie aktywności BatR, SrkA, pyocyn lub Pf4 mogłoby zwiększać penetrację antybiotyków albo ograniczać zdolność bakterii do odbudowy macierzy.

Na tym etapie jest to jednak koncepcja badawcza. Nie opracowano inhibitora BatR ani SrkA, nie wykazano jego skuteczności w organizmie i nie oceniono bezpieczeństwa takiej strategii. Szczególnej ostrożności wymaga ingerowanie w układy lityczne i fagowe, ponieważ mogą one wpływać nie tylko na strukturę biofilmu, ale również na uwalnianie antygenów, toksyn, DNA i pęcherzyków błonowych.

Dalsze prace powinny objąć kliniczne izolaty Pseudomonas aeruginosa, szczepy pochodzące od osób z mukowiscydozą, modele wielogatunkowych biofilmów oraz ocenę, czy blokowanie układu BatR/SrkA rzeczywiście zwiększa skuteczność antybiotyków bez niepożądanego nasilania wirulencji lub selekcji wariantów ucieczkowych.