AI analizuje mikroskopową sieć śluzu 40–120 razy szybciej niż człowiek

Naukowcy z berlińskich ośrodków badawczych opracowali szczegółowy protokół automatycznej analizy mikroskopowych obrazów ludzkiego śluzu. System wykorzystujący uczenie maszynowe rozpoznaje pory, włókna i połączenia tworzące sieć śluzową, a następnie wykonuje pomiary ilościowe nawet 40–120 razy szybciej niż ekspert analizujący obrazy ręcznie. Autorzy podkreślają jednak, że jest to narzędzie badawcze, a jego przydatność do oceny śluzu pacjentów z mukowiscydozą wymaga dopiero bezpośredniego potwierdzenia.

Dlaczego struktura śluzu ma znaczenie

Śluz jest złożonym hydrożelem tworzącym przestrzenną, siateczkowatą strukturę. Pokrywa między innymi powierzchnię nabłonka dróg oddechowych i przewodu pokarmowego, uczestnicząc w ochronie tkanek, utrzymaniu homeostazy oraz ograniczaniu kontaktu komórek nabłonka z drobnoustrojami, toksynami i cząstkami pochodzącymi ze środowiska.

W drogach oddechowych śluz stanowi jeden z podstawowych elementów mechanizmu oczyszczania śluzowo-rzęskowego. Powinien skutecznie wychwytywać wdychane cząstki i patogeny, a jednocześnie pozostawać wystarczająco ruchomy, aby mógł być transportowany w kierunku gardła przez ruch rzęsek nabłonka. Właściwości te zależą nie tylko od składu chemicznego śluzu, ale również od jego uwodnienia, lepkości, sprężystości i organizacji mikroskopowej sieci mucyn.

W chorobach takich jak mukowiscydoza dochodzi do zmian uwodnienia i właściwości fizycznych wydzieliny. Nadmiernie zagęszczony śluz może być trudniej usuwany z dróg oddechowych, sprzyjać powstawaniu czopów śluzowych oraz tworzyć środowisko ułatwiające utrzymywanie się przewlekłych zakażeń i stanu zapalnego. Zmiany struktury śluzu obserwuje się również w chorobach przewodu pokarmowego, w tym w chorobie Leśniowskiego-Crohna.

Jednym z parametrów opisujących śluz jest wielkość porów występujących między włóknistymi elementami jego sieci. Rozmiar porów może wpływać na przepuszczalność bariery śluzowej, przemieszczanie się cząstek, zatrzymywanie drobnoustrojów oraz możliwość przenikania leków podawanych w nośnikach cząsteczkowych. Długość i szerokość filamentów, liczba rozgałęzień oraz sposób ich połączenia mogą natomiast dostarczać informacji o przestrzennej organizacji śluzu.

Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwala obrazować te struktury z bardzo dużą rozdzielczością. Problemem pozostaje jednak ich ilościowa analiza. Ręczne wyznaczanie średnic porów, długości filamentów i ich szerokości jest czasochłonne, wymaga doświadczenia i może prowadzić do różnic między wynikami uzyskiwanymi przez poszczególnych badaczy.

Autorzy i ośrodki badawcze

Szczegółowy protokół opracował interdyscyplinarny zespół łączący kompetencje z zakresu chemii, biologii śluzu, pulmonologii dziecięcej, gastroenterologii, anatomii, mikroskopii elektronowej, przetwarzania danych i uczenia maszynowego.

Wśród autorów znaleźli się między innymi Yannic Kerkhoff, Hanna Rulff, Paul W. Mönch, Catharina Gutwein, Aditi Loewe, Sara Timm, Ruth M. Urbantat, Marcus A. Mall, Britta Siegmund i Matthias Ochs. Autorami korespondencyjnymi publikacji są Yannic Kerkhoff oraz Matthias Ochs.

Badacze reprezentowali między innymi:

• Institute of Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin,
• IT & Data Services, Zuse Institute Berlin,
• Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin,
• Department of Gastroenterology, Infectiology and Rheumatology, Charité – Universitätsmedizin Berlin,
• Department of Pediatric Respiratory Medicine, Immunology and Critical Care Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin,
• Core Facility Electron Microscopy, Charité – Universitätsmedizin Berlin,
• Institute of Functional Anatomy, Charité – Universitätsmedizin Berlin,
• German Center for Lung Research (DZL),
• German Center for Child and Adolescent Health (DZKJ),
• Berlin Institute of Health (BIH).

Materiał biologiczny i obrazowanie SEM

Pobieranie śluzu z dróg oddechowych

Próbki śluzu z dróg oddechowych uzyskano od trzech zdrowych uczestników. Wydzielanie plwociny indukowano przez inhalację hipertonicznego roztworu chlorku sodu o stężeniu 3–6%, wykonywaną przy użyciu systemu PARIBOY połączonego z nebulizatorem PARI LC PLUS. Po odkrztuszeniu materiału ślinę ostrożnie usuwano przez delikatną aspirację pipetą, a próbki dzielono na porcje przeznaczone do dalszego przygotowania.

Z udziału wykluczano między innymi osoby palące, pacjentów z ostrym zakażeniem układu oddechowego, zaostrzeniem choroby płuc, przebytym przeszczepieniem narządu lub przewlekłą chorobą płuc. Oznacza to, że na tym etapie badacze analizowali śluz osób zdrowych, a nie próbki pobrane od pacjentów z mukowiscydozą.

Pobieranie śluzu z jelita krętego

Materiał jelitowy pobierano w Department of Gastroenterology, Infectiology and Rheumatology, Charité – Universitätsmedizin Berlin podczas kolonoskopii wykonywanej u zdrowych dawców w ramach badań przesiewowych w kierunku raka jelita grubego. Po wprowadzeniu endoskopu do końcowego odcinka jelita krętego śluz pobierano z powierzchni błony śluzowej przy użyciu cewnika płuczącego.

Unikano obszarów z dużą ilością płynu, a próbki zanieczyszczone krwią, treścią kałową lub nadmiarem płynu wykluczano. Do przedstawionej analizy wybrano jedną próbkę pochodzącą od zdrowej osoby.

Przygotowanie próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej

Do maksymalnie 100 µg śluzu dodawano dziesięciokrotnie większą objętość 2,5-procentowego aldehydu glutarowego w buforze kakodylanowym. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej próbki przechowywano w temperaturze 4°C.

Następnie materiał utrwalano dodatkowo w 1-procentowym tetratlenku osmu, odwadniano w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu i suszono w punkcie krytycznym. Procedura suszenia w punkcie krytycznym miała ograniczyć deformację powierzchniowej struktury próbek, która mogłaby wystąpić podczas standardowego odparowywania cieczy.

Preparaty umieszczano na uchwytach mikroskopowych, napylano warstwą złota i palladu, a następnie obrazowano w skaningowym mikroskopie elektronowym GeminiSEM300 przy napięciu przyspieszającym 7 kV.

Systematyczne jednorodne próbkowanie losowe

Aby ograniczyć ryzyko wybierania wyłącznie najbardziej reprezentacyjnych lub najlepiej wyglądających fragmentów próbki, zastosowano systematyczne jednorodne próbkowanie losowe. Preparat skanowano według meandrującego schematu, rozpoczynając od losowo wybranego punktu i przesuwając pole widzenia w regularnych odstępach.

Obrazy wykonywano przy różnych powiększeniach mikroskopowych, między innymi 50 000×, 30 000×, 5000×, 1000× i 100×. Do ilościowej analizy drobnych elementów sieci śluzowej wykorzystywano przede wszystkim obrazy uzyskane przy powiększeniu 50 000×.

W przypadku śluzu z jelita krętego konieczne było zmodyfikowanie protokołu próbkowania ze względu na mniejszą gęstość sieci i większą niejednorodność materiału. Badacze wprowadzili określone linie akceptacji i odrzucenia, aby zachować zasady bezstronnego zliczania struktur znajdujących się na granicach analizowanego pola.

Jak działa system wykorzystujący sztuczną inteligencję

Automatyczny system został zbudowany w środowisku Fiji z wykorzystaniem rozszerzenia Trainable Weka Segmentation. Podstawą klasyfikacji był perceptron wielowarstwowy, czyli rodzaj sztucznej sieci neuronowej zdolnej do przypisywania poszczególnych pikseli obrazu do określonych klas.

Model miał dwie warstwy ukryte, z których każda zawierała 70 neuronów. Został nauczony rozpoznawania czterech klas elementów obrazu:

• ciemnych porów,
• jasnych porów,
• ciemnych włókien,
• jasnych włókien.

Podział na jasne i ciemne obszary miał zwiększyć odporność klasyfikatora na różnice kontrastu, poziomu szumu i sposobu oświetlenia próbek. W tradycyjnej analizie opartej wyłącznie na prostym progu jasności takie różnice mogłyby prowadzić do błędnego oddzielania struktury śluzu od tła.

Przygotowanie danych treningowych

Autorzy zalecają, aby do treningu lub ponownego dostosowania modelu wykorzystywać około 5–10% obrazów z całego analizowanego zbioru. Wybrane obrazy powinny obejmować pełne spektrum różnic morfologicznych występujących w materiale. W przypadku zbioru 100 obrazów oznaczałoby to wybór około 5–10 reprezentatywnych obrazów treningowych.

Badacz ręcznie zaznacza na nich obszary odpowiadające poszczególnym klasom, uruchamia trening klasyfikatora, a następnie sprawdza wynik segmentacji. Fragmenty rozpoznane błędnie mogą być ponownie oznaczane i dodawane do danych treningowych. Autorzy wykonali pięć etapów udoskonalania i ponownego trenowania modelu, zanim dołączyli obrazy pochodzące z kolejnych serii eksperymentalnych.

Model trenowano przez 500 epok. Zastosowano między innymi rozmycie Gaussa, filtr Sobela, analizę macierzy Hessego, różnicę funkcji Gaussa, projekcje błonowe oraz lokalne parametry statystyczne, takie jak średnia, maksimum, minimum i wariancja intensywności pikseli.

Automatyczna segmentacja obrazu

Po wczytaniu surowego obrazu system może przeprowadzić wyrównanie intensywności, które normalizuje kontrast. Klasyfikator przypisuje następnie każdemu pikselowi prawdopodobieństwo przynależności do poru albo filamentu, tworząc mapy prawdopodobieństwa.

Mapy te są przekształcane w obrazy binarne przy użyciu progowania metodą Otsu. Następnie stosowany jest filtr medianowy o promieniu czterech pikseli, którego zadaniem jest ograniczenie szumu przy możliwie dobrym zachowaniu ciągłości badanych struktur.

Sieć filamentów jest poddawana szkieletyzacji. W jej wyniku włókna zostają zredukowane do linii o szerokości jednego piksela, ale zachowana zostaje ich topologia, w tym punkty końcowe, rozgałęzienia i połączenia. Rozszerzenie Analyze Skeleton umożliwia następnie obliczenie długości poszczególnych odcinków i charakterystyki rozgałęzień.

Do analizy szerokości filamentów wykorzystywane jest przekształcenie Voronoi. System określa lokalną szerokość włókna wzdłuż jego przebiegu i wyznacza minimalną szerokość każdego segmentu. Takie podejście pozwala uwzględnić miejscowe zwężenia, które mogłyby zostać utracone podczas obliczania jedynie wartości średniej.

Pory głębokie i płytkie są początkowo analizowane oddzielnie, a następnie łączone. Dla każdego poru zapisywane są między innymi powierzchnia i minimalna średnica Fereta, czyli najmniejsza odległość między dwiema równoległymi liniami stycznymi ograniczającymi analizowany obiekt.

Bezstronna ramka zliczająca

System wykorzystuje centralnie położoną ramkę zliczającą obejmującą określony odsetek powierzchni obrazu. Struktury przecinające górną lub prawą krawędź, określane jako linie akceptacji, są uwzględniane w analizie. Obiekty dotykające dolnej lub lewej krawędzi są odrzucane.

Takie reguły ograniczają ryzyko wielokrotnego zliczania tych samych obiektów i zmniejszają zależność wyniku od ich rozmiaru, kształtu lub orientacji. W analizie manualnej ramka obejmowała 3% centralnej powierzchni obrazu, natomiast w podstawowej analizie automatycznej zastosowano ramkę 5-procentową.

Kontrola jakości i łączenie wyników

Dla każdego obrazu program tworzy tabelę wyników, obraz binarny oraz nakładkę walidacyjną. Na obrazie kontrolnym głębokie pory oznaczane są kolorem czerwonym, pory płytkie zielonym, filamenty niebieskim, a miejsca połączeń sieci kolorem purpurowym.

Autorzy wyraźnie zalecają ręczne sprawdzanie nakładek walidacyjnych. Tabele odpowiadające obrazom, na których segmentacja jest nieprawidłowa, powinny zostać usunięte przed połączeniem wyników. Oznacza to, że system automatyzuje zasadniczą część pomiarów, ale nie eliminuje odpowiedzialności badacza za ocenę jakości analizy.

Do łączenia wyników z wielu obrazów przygotowano skrypt napisany w języku Python. Program odczytuje poszczególne tabele, łączy wartości dotyczące powierzchni i średnic porów oraz długości i szerokości filamentów, a następnie tworzy plik podsumowujący i wykresy przedstawiające rozkłady pomiarów. Obliczane są między innymi mediana, dominanta oszacowana metodą estymacji gęstości jądrowej oraz odchylenie standardowe.

Wyniki porównania z analizą ekspertów

W analizie śluzu dróg oddechowych wykorzystano łącznie 99 obrazów pochodzących z trzech próbek. W analizie śluzu jelita krętego uwzględniono 38 obrazów pochodzących z jednej próbki. Wszystkie obrazy przeznaczone do automatycznego przetwarzania wykonano przy powiększeniu 50 000×.

Pomiary manualne obejmowały identyfikowanie średnicy porów, długości filamentów i ich szerokości. W ramach 3-procentowej ramki zliczającej ręczna analiza jednego obrazu zajmowała od około 10 do 30 minut.

Automatyczna analiza wykonywana na laptopie z procesorem Intel Core i9-12900H, 16 GB pamięci RAM i systemem Windows 11 trwała około 15 sekund na obraz. W zależności od czasu potrzebnego ekspertowi oznaczało to przyspieszenie analizy od 40 do 120 razy.

Zmienność między ekspertami

Aby określić typowy poziom różnic między ludźmi, dwóch ekspertów przeanalizowało ten sam zestaw 31 obrazów śluzu dróg oddechowych. Następnie porównano rozkłady uzyskanych średnic porów, długości filamentów i ich szerokości.

Wielkości efektu wyrażone współczynnikiem korelacji Pearsona r wynosiły w porównaniach między ekspertami od 0,16 do 0,39. Zakres ten potraktowano jako punkt odniesienia opisujący zmienność między obserwatorami wykonującymi pomiary ręcznie.

Porównanie eksperta z systemem AI

Jeden z ekspertów przeanalizował ręcznie pełny zbiór 99 obrazów śluzu dróg oddechowych. Automatyczny system przetworzył ten sam materiał, umożliwiając bezpośrednie porównanie rozkładów wyników.

W porównaniach danych generowanych przez eksperta i system AI wartości r mieściły się w zakresie 0,01–0,18. Były zatem niższe niż wartości obserwowane w części porównań między dwoma ekspertami. Podobne rezultaty uzyskano dla śluzu jelita krętego.

Autorzy interpretują te wyniki jako potwierdzenie, że zmienność występująca między pomiarami człowieka i systemu AI nie przekraczała zmienności obserwowanej między ekspertami. Nie oznacza to, że system był bezbłędny, ale wskazuje, że w analizowanym materiale mógł stanowić odpowiednią alternatywę dla pracochłonnych pomiarów manualnych.

Czy większa ramka zliczająca zmienia wyniki?

Automatyzacja pozwala zwiększyć powierzchnię ramki zliczającej bez wydłużania czasu pracy badacza. Autorzy porównali wyniki uzyskane dla ramek obejmujących 5% i 30% powierzchni obrazów śluzu jelita krętego.

Wielkości efektu wynosiły od 0,001 do 0,07, co wskazywało, że zwiększenie powierzchni ramki nie zmieniło istotnie rozkładów mierzonych struktur. Badacze zaznaczają jednak, że zwiększenie ilości danych pochodzących z pojedynczego obrazu nie musi dostarczać proporcjonalnie większej ilości informacji.

Zamiast rozszerzać ramkę na znaczną część każdego obrazu, autorzy zalecają przede wszystkim analizowanie większej liczby obrazów pochodzących z większej liczby niezależnych próbek. Takie postępowanie może lepiej odzwierciedlać biologiczną zmienność materiału niż wykonywanie bardzo dużej liczby pomiarów w ograniczonej liczbie obrazów.

Znaczenie dla badań nad mukowiscydozą i ograniczenia metody

Opracowany system może ułatwić prowadzenie badań nad mikrostrukturą śluzu w chorobach przebiegających z zaburzeniem jego właściwości. W mukowiscydozie szczególne znaczenie mogłaby mieć ilościowa ocena zmian wielkości porów, grubości elementów sieci i stopnia jej rozgałęzienia.

W przyszłych badaniach metoda mogłaby być wykorzystywana między innymi do porównywania śluzu osób zdrowych i pacjentów z mukowiscydozą, oceny zmian występujących w różnych stadiach choroby lub sprawdzania, czy określone interwencje wpływają na ultrastrukturę sieci śluzowej.

Potencjalnym obszarem zastosowania są także badania nad przenikaniem leków i nośników cząsteczkowych przez warstwę śluzu. Jeżeli rozmiar i organizacja porów ograniczają ruch określonych cząstek, ich ilościowy pomiar może pomagać w projektowaniu systemów dostarczania leków lepiej dostosowanych do właściwości patologicznej wydzieliny.

Publikacja nie dowodzi jednak, że opracowana metoda rozpoznaje mukowiscydozę, przewiduje przebieg choroby albo pozwala dobrać leczenie dla konkretnego pacjenta. W przedstawionej walidacji nie analizowano materiału od osób z mukowiscydozą ani od pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna. Odniesienie do tych chorób dotyczy potencjalnego kierunku przyszłych badań.

Rzadkie filamenty i ryzyko powstawania pseudo-porów

Najważniejszym problemem opisanym przez autorów są obrazy zawierające bardzo rzadką sieć filamentów. Cienie znajdujące się przy krawędziach niewielkich skupisk śluzu mogą zostać błędnie rozpoznane jako pory, mimo że w rzeczywistości stanowią jedynie granicę małej kropli lub fragmentu materiału.

Jeżeli w próbce występuje wiele prawidłowych, dobrze rozpoznanych porów, pojedyncze błędne klasyfikacje nie muszą istotnie wpływać na cały rozkład wyników. Jeżeli jednak próbka składa się głównie z rzadkich skupisk śluzu, duża liczba pseudo-porów może prowadzić do mylących pomiarów.

Mała liczba dawców

Chociaż liczba przeanalizowanych obrazów była stosunkowo duża, materiał pochodził jedynie od trzech dawców śluzu dróg oddechowych i jednego dawcy śluzu jelitowego. Duża liczba pomiarów wykonanych w obrazach pochodzących z tej samej próbki nie zastępuje większej liczby biologicznie niezależnych uczestników.

Wyniki potwierdzają przede wszystkim techniczną zgodność automatycznego i manualnego sposobu pomiaru w wykorzystanym materiale. Nie pozwalają natomiast określić pełnej zmienności struktury śluzu w populacji ani różnic między osobami zdrowymi i pacjentami z poszczególnymi chorobami.

Odtwarzalność i dostępność narzędzi

Istotną zaletą pracy jest udostępnienie makra Fiji, wstępnie wytrenowanego modelu, skryptu łączącego dane, surowych i przetworzonych obrazów oraz instrukcji wideo. Materiały umieszczono w repozytorium Zenodo pod adresem DOI 10.5281/zenodo.16272454.

Badacze mogą wykorzystać gotowy klasyfikator albo ponownie go wytrenować na własnych obrazach. Autorzy zalecają przy tym dokładne dokumentowanie parametrów analizy, wersji modelu, sposobu przygotowania próbek i struktury folderów projektu. Ma to umożliwić późniejsze odtworzenie całego przebiegu analizy.

W dalszej perspektywie zespół proponuje połączenie wszystkich etapów w jedną aplikację działającą bezpośrednio na komputerze obsługującym mikroskop elektronowy. Takie rozwiązanie mogłoby ograniczyć rozdzielenie procesu obrazowania i późniejszego przetwarzania danych.

Podsumowanie

Protokół opracowany przez Kerkhoffa i współpracowników pokazuje, że uczenie maszynowe może znacząco przyspieszyć ilościową analizę mikroskopowych sieci ludzkiego śluzu. Automatyczne przetwarzanie obrazów trwało około 15 sekund na obraz, podczas gdy analiza manualna wymagała od 10 do 30 minut.

Rozkłady średnic porów, długości filamentów i ich szerokości uzyskane przez system były zgodne z wynikami ekspertów. Różnice między pomiarami człowieka i AI nie były większe niż różnice występujące między dwoma osobami wykonującymi analizę ręcznie.

Metoda może zwiększyć przepustowość badań, ograniczyć wpływ zmęczenia obserwatora i ułatwić stosowanie jednolitych parametrów analizy w dużych zbiorach obrazów. Jej szczególna wartość może dotyczyć badań nad zaburzeniami struktury śluzu w mukowiscydozie i innych chorobach śluzowo-obturacyjnych.

Przed zastosowaniem w badaniach klinicznych konieczna jest jednak walidacja na większej liczbie biologicznie niezależnych próbek, w tym na materiale pobranym od pacjentów z mukowiscydozą. Niezbędne będzie również określenie, czy mierzone parametry ultrastrukturalne mają związek z właściwościami reologicznymi śluzu, transportem śluzowo-rzęskowym, czynnością płuc, zakażeniami i odpowiedzią na leczenie.

Źródło: American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, Efficient AI-supported quantification of network structures in SEM imaged human mucus: A detailed protocol.
DOI: https://doi.org/10.1152/ajplung.00009.2026